1、食品微生物学检验菌落总数测定1范围本标准规定了食品中菌落总数的测定方法。本标准适于食品中菌落总数的测定方法。2术语和定义菌落总数:指食品检样经过处理,在一定条件下培养后(如培基成分、培养温度和时间、pH、需氧性质等),所得1mL(g)检样中所含菌落的总数3设备和材料恒温培养箱:361 301;冰箱:25;恒温水浴:461;天平:感量为0.1g;均质器;震荡器;无菌吸管1mL、10mL或微量移液器及吸头;无菌锥形瓶:250 mL;500 mL;无菌培养皿:直径90mm;pH计或pH比色管或精密pH试纸;放大镜、菌落计数器4培养基和试剂4.1平板计数琼脂培养基4.1.1成分胰蛋白胨5.0g酵母浸膏
2、2.5g葡萄糖1.0g琼脂15.0g蒸馏水1000mLpH7.00.24.1.2制法将上述成分加入到蒸馏水中,煮沸溶解,调节pH。分装试管和锥形瓶,121高压灭菌15min。4.2磷酸盐缓冲液4.2.1成分磷酸二氢钾KH2PO434.0g蒸馏水500mLpH7.24.2.2制法贮存液:称取34.0g的磷酸二氢钾溶于500mL蒸馏水中,用大约175mL的1mol/L的氢氧化钠溶液调节pH,用蒸馏水稀释至1000mL后贮存于冰箱。稀释液:取贮存液1.25mL,用蒸馏水稀释至1000mL,分装于适宜容器中,121高压灭菌15min。4.3无菌生理盐水4.3.1成分氯化钠8.5g蒸馏水1000mL4.
3、3.2称取8.5g氯化钠溶于1000mL蒸馏水中,121高压灭菌15min。5检验程序菌落总数的检验程序如下:检样25g(或25mL)样品+225mL稀释液,均质10倍系列稀释选择23个适宜样品匀液,各取1mL分别加入无菌培养皿内每皿中加入15 20mL平板计数琼脂培养基,混匀培养36148 h2 h计算各平板菌落数计算菌落总数报告6操作步骤6.1 样品的稀释6.1.1 固体和半固体样品:称取25g 样品置盛有225 mL 磷酸盐缓冲液或生理盐水的无菌均质杯内,8 000r/min10 000r/min 均质1 min2 min ,或放人盛有225 mL 稀释液的无菌均质袋中,用拍击式均质器拍
4、打1 min2 min ,制成1:10 的样品匀液。6.1.2 液体样品:以无菌吸管吸取25 mL 样品置盛有225 mL 磷酸盐缓冲液或生理盐水的无菌锥形瓶(瓶内预置适当数量的无菌玻璃珠)中,充分混匀,制成1 :10 的样品匀液。6.1.3 用1 mL 无菌吸管或微量移液器吸取1: 10 样品匀液1 mL ,沿管壁缓慢注于盛有9 mL 稀释液的无菌试管中(注意吸管或吸头尖端不要触及稀释液面),振摇试管或换用一支无菌吸管反复吹打使其混合均匀,制成1:100 的样品匀液。6.1.4 按3.1.3 操作程序,制备10 倍系列稀释样品匀液。每递增稀释一次,换用一次1 mL无菌吸管或吸头。6.1.5
5、根据对样品污染状况的估计,选择2 个3 个适宜稀释度的样品匀液(液体样品可包括原液), 在进行10 倍递增稀释时,每个稀释度分别吸取1 mL 样品匀液加人两个无菌平皿内。同时分别取1 mL 稀释液加人两个无菌平皿作空白对照。6.1.6 及时将15 mL20 mL 冷却至46 的平板计数琼脂培养基(可放置于46 1 恒温水浴箱中保温)倾注平皿,并转动平皿使其混合均匀。6.2 培养6.2.1 琼脂凝固后,将平板翻转,36 1 培养48h2h 。水产品30 1 培养72h3h.6.2.2 如果样品中可能含有在琼脂培养基表面弥漫生长的菌落时,可在凝固后的琼脂表面覆盖一薄层琼脂培养基(约4 mL ) ,
6、凝固后翻转平板,按6.2.1 条件进行培养。6.3 菌落计数可用肉眼观察,必要时用放大镜或菌落计数器,记录稀释倍数和相应的菌落数量。菌落计数以菌落形成单位(colony - forming units , CFU )表示。6.3.1 选取菌落数在30 CFU300 CFU 之间、无蔓延菌落生长的平板计数菌落总数。低于30 CFU 的平板记录具体菌落数,大于300 的可记录为多不可计。每个稀释度的菌落数应采用两个平板的平均数。6.3.2 其中一个平板有较大片状菌落生长时,则不宜采用,而应以无片状菌落生长的平板作为该稀释度的菌落数;若片状菌落不到平板的一半,而其余一半中菌落分布又很均匀,即可计算半
7、个平板后乘以2 ,代表一个平板菌落数。6.3.3 当平板上出现菌落间无明显界线的链状生长时,则将每条单链作为一个菌落计数。7 结果与报告7.1 菌落总数的计算方法7.1.1 若只有一个稀释度平板上的菌落数在适宜计数范围内,计算两个平板菌落数的平均值,再将平均值乘以相应稀释倍数,作为每克(或毫升)中菌落总数结果。7.1.2 若有两个连续稀释度的平板菌落数在适宜计数范围内时,按式(l )计算:N=C/(n1+0.1n2)d(1 ) 式中:N 样品中菌落数;C 平板(含适宜范围菌落数的平板)菌落数之和;nl 第一稀释度(低稀释倍数)平板个数;n2 第二稀释度(低稀释倍数)平板个数;d 稀释因子(第一
8、稀释度)。7.1.3 若所有稀释度的平板上菌落数均大于300 ,则对稀释度最高的平板进行计数,其他平板可记录为多不可计,结果按平均菌落数乘以最高稀释倍数计算。7.1.4 若所有稀释度的平板菌落数均小于30 ,则应按稀释度最低的平均菌落数乘以稀释倍数计算。7.1.5 若所有稀释度(包括液体样品原液)平板均无菌落生长,则以小于1 乘以最低稀释倍数计算。7.1.6 若所有稀释度的平板菌落数均不在30300 之间,其中一部分小于30 或大于300 时,则以最接近30 或300 的平均菌落数乘以稀释倍数计算。7.2 菌落总数的报告7.2.1 菌落数在100 以内时,按“四舍五入”原则修约,以整数报告。7.2.2 菌落数大于或等于100 时,第3位数字采用“四舍五入”原则修约后,取前2位数字,后面用0代替位数;也可用10 的指数形式来表示,按“四舍五入”原则修约后,采用两位有效数字。7.2.3 若所有平板上为蔓延菌落而无法计数,则报告菌落蔓延。7.2.4 若空白对照上有菌落生长,则此次检测结果无效。7.2.5 称重取样以CFU/g 为单位报告,体积取样以CFU/mL 为单位报告。