酵母菌生物降解山楂汁中有机酸的研究.doc

1、烟台大学毕业论文任务书院（系）：化学生物理工学院姓名学号毕业届别2011专业食品科学与工程毕业论文题目酵母菌生物降解山楂汁中有机酸的研究指导教师学历博士职称副教授所学专业发酵工程具体要求： 1）认真查阅相关资料，弄清实验目的、意义，搞好整体设计。 2）认真探索实验方法，找出实验关键。 3）熟练实验操作技术，保证实验数据的准确性。 4）实验数据真实可靠，文献引用要合理，论文撰写要规范。主要内容：从天然果皮中富集、分离、纯化筛选出不同酵母菌，并接种到相同pH，不同体积的山楂汁中，山楂汁主要含柠檬酸，通过摇瓶培养，测定总酸、柠檬酸、黄酮含量的变化，比较酵母菌降酸情况并分析讨论，分离出能够有效降解柠檬

2、酸且保留黄酮的菌种。主要参考资料：1 Cletus PKurtzman WThe Yeast，A Taxonomic StudyMElseriver AmsterdamLausanneNew YorkOxfordShannonSingaporeTokyo，19982 沈萍微生物学实验M北京：高等教育与出版社2007.11:28-34，51-56进度安排： 第1-2周：确定论文题目，布置文献查阅相关事宜，写开题报告。 第3-9周：进行实验并记录实验数据 第10-11周：实验数据整理分析第11-14周：论文写作指导教师（签字）： 年 月 日院（系）意见： 教学院长（主任）（签字）： 年 月 日备注

3、：摘要山楂汁中主要含有的是柠檬酸，文章主要从天然水果皮中通过微生物的富集、分离、纯化，筛选出不同种类的酵母菌，并将它们接种到山楂汁中，摇瓶培养，观察、检测它们柠檬酸的生物降解的情况。并得到一种或几种既能很好的降解酸又能保持山楂汁中黄酮含量稳定的酵母菌菌种。关键词：山楂汁；酵母菌；柠檬酸；黄酮；生物降解Abstract：Hawthorn juice contains plenty of citric acid, the article mainly from the station by yeasts through the rind enrichment, separation, purifi

4、cation, and choose different kinds of yeasts. Then vaccinate them to the hawthorn juice and flask culture, then to observe and examine their biodegradation of citric acid. Finally we want to get one or several yeasts can both very good degradation acid and keep hawthorn juice flavonoid content stabl

5、e yeast strain.Key words：hawthorn juice; yeast; citric acid; flavonoids; biodegrade目 录1 前 言12 实验材料2 2.1 菌种的筛选与鉴定2 2.1.2 菌种的选择2 2.1.2 菌种的来源2 2.1.3 筛选方法2 2.2 山楂汁的制作33 实验方法4 3.1 山楂汁的降酸发酵4 3.2 柠檬酸的测定4 3.3 黄酮的测定44 实验结果分析与记录6 4.1 菌种的筛选分析6 4.2 酵母菌的富集培养分析6 4.3 山楂汁的降酸发酵分析8 4.3.1 柠檬酸分析8 4.3.2 黄酮分析10 4.3.3 高效液

6、相色谱图分析125 实验结果176 结 论18致 谢19参考文献20III烟台大学毕业论文1 前 言山楂（Crataegus pinnatifida）蔷薇科，苹果亚科，山楂属植物，别名：山里果、红果。多指其果实。可食用，质硬，肉薄，味酸涩。山楂的产地很广，遍及大江南北，主要有山东、河南、浙江、湖北等地，多为秋季采摘食用。自古以来，山楂具有非常重要的药用价值，中医常视之为治病良药，主治：开胃健脾、活血化痰、消食化滞、收敛止痢、伤风感冒、胸膈脾满、食欲不振、儿童缺铁性贫血症、儿童软骨缺钙症等。山楂中含有多种对人体有益的营养成分，如淀粉、糖类、蛋白质、脂肪、胡萝卜素、维生素C、苹果酸、枸杞酸、铁和钙

7、的物质1。山楂的所含物质还能够通过增强心肌收缩力、扩张冠状动脉血管、增加心脏血液输出量、降低心肌耗氧量、增加冠状动脉血流量等有效地降血脂、血压和强心、抗心律不齐、心绞痛等功效。但是，起关键作用的是山楂中的黄酮类物质2。目前，已经从山楂中分离出30余种黄酮成分，有含碳键的黄酮苷类、双氧黄酮苷类、黄酮醇及其苷类、聚合黄酮类。黄酮类化合物具有抗氧化、抗肿瘤、抗突变和保护心血管的多种特殊的生物功能作用，是植物化学物近些年的研究热点3。正因为它维护心脑血管的如此功效，在应用中就要尽可能地保留黄酮类物质等重要成分，在改善色、香、味等口感的基础上，使山楂类产品更能为广大消费者所接受。在山楂汁的制作过程中最显

8、著的特点就是山楂汁所含有的大量有机酸，如柠檬酸、酒石酸、L-苹果酸、山楂酸、咖啡酸、绿原酸、齐墩果酸等4。它们的含量限制了对山楂的有效利用5。因此，文章就是要利用生物化学或者物理化学的方法降解其中的有机酸，提高其pH值，并保留其黄酮含量的稳定。山楂汁的降酸方法有很多，如稀释降酸法、酒石酸沉淀法、碳酸钙沉淀法、吸附树脂降酸法、碱中和法、电渗析法等物化方法和微生物在有氧条件、厌氧条件6下的发酵降酸。其中，物化方法虽简单易行，降酸作用显著，但是对山楂汁的其它成分的影响较大，很难平衡其组成，在生产试验当中达不到理想效果。而这篇文章主要介绍微生物在有氧条件下对山楂汁降酸情况的研究且以柠檬酸含量为检测标准

9、，通过有效的手段分析比较然后筛选出保留黄酮的酵母菌，并测定它的降酸情况，观察其形态及生长规律。2 实验材料2.1 菌种的筛选与鉴定2.1.1 菌种的选择自然界中能够利用柠檬酸的微生物分布广泛，种类繁多，有细菌、酵母菌、霉菌等。相比于细菌、霉菌，酵母菌的优势在于其低pH的高生长活力；各个阶段生长非常有规律、新陈代谢各个环节条理明晰，且产物、菌体易于分离，符合现代提倡的安全卫生的操作管理理念；此外，酵母菌菌体及其菌体蛋白7,8还能充分回收利用，广泛用于其它工业化生产工艺，如细胞工程、发酵工程、酶工程等等，是资源配置优化的一种手段。天然存在的酵母菌通常具有以下5个特点：单细胞状，多营出芽生殖，发酵糖

10、产能，壁多含甘露聚糖，于含糖高、酸度大的水生环境中生存9。其中，以柠檬酸作碳源彻底氧化分解或经糖异生途径利用柠檬酸转化为另一种物质能同化柠檬酸的酵母菌据文献记载有400多种10。因此，从酵母菌中筛选出能够降解柠檬酸的菌种是可能的，而理想的目的菌种应具有以下9种特征：（1） 通过自身代谢分解总酸中的柠檬酸，使pH上升。（2） 保留黄酮等生物活性物质。（3） 不影响山楂汁风味或优于山楂汁风味。（4） 能提供山楂汁生产过程所需的一些诱导物或酶等。（5） 菌体易分离获取。（6） 菌种遗传物质稳定，抗逆性强，不易变异。（7） 菌体能回收用于其它生产8。（8） 初级、次级代谢产物不产生抗生素、毒素、过敏原

11、等对人体健康有害的物质。（9） 发酵后废液经处理不造成环境污染。2.1.2 菌种的来源酵母菌分布在自然界偏酸含糖的环境中，如水果、花、树皮和果园土壤中11。实验小组4人分别搜集了烟台山楂、莱阳梨、海南芒果、南方菠萝这4种水果的若干表皮组织且编号为1、2、3、4，用以分离天然降酸的菌种。培养基10的选择与配制：富集培养基：柠檬酸 20 g，硫酸铵 5 g，硫酸镁 0.24 g，磷酸二氢钾 1 g，酵母膏 0.2 g，氯化钠 0.1 g，无水氯化钙 0.1 g，溶于 1 L去离子水中。固体分离培养基：琼脂 25 g，硫酸铵 5 g，硫酸镁 0.24 g，酵母膏 0.2 g，磷酸二氢钾 1 g，氯化

12、钠 0.1 g，无水氯化钙 0.1 g，将其溶于 800 mL去离子水中；同时，将 20 g柠檬酸溶于 200 mL水中；湿热灭菌 115 约 15 min，冷却至 45 - 50 ，混合，取洁净灭菌培养皿，倒平板。保存培养基：葡萄糖、琼脂各取 2 %（w/v），蛋白胨 1 %（w/v），酵母膏 0.5 %（w/v）。2.1.3 筛选方法预处理：分别取面积为 25 cm2未经清洗的新鲜水果皮样品于 250 mL的锥形瓶中，每个瓶中各加入 100 mL经湿热灭菌冷却后的富集培养基，并放入摇床，室温下 70 r/min摇瓶培养 1 d，观察培养液的浑浊程度。浑浊程度是菌体数量的客观反映。因为，刚接

13、入培养基时，微生物需要进入一个调整期，产生相应的酶系，才能进一步生长、繁殖；所以，若与前一天相比浊度变化不太明显，一方面是微生物处于适应阶段，未出现繁殖现象，另一方面是果皮上的微生物种类不能利用该培养基，不适应该环境，不能生长。当出现以上情况时，则需要再培养 1 d，观察并记录现象。相反，若培养液变浑浊了，且散发出淡淡的酒香，则应取出静置至澄清，视情况取一定体积的上清液，弃去废液。菌种富集：分别取上述4种预处理上清液各 1 mL于 250 mL锥形瓶中，每个瓶中各加入 100 mL经湿热灭菌冷却后的富集培养基，室温下 70 r/min摇瓶培养 1 d，同预处理方式一样，观察记录培养液的浑浊程度

14、。依次富集、转接、富集，相同条件下连续转接培养 5 - 6 次后，酵母菌即成为优势菌种。此后，需根据菌体的数量级确定菌种分离的稀释倍数。菌体的计数方法采用血球板计数法12，该法属于显微镜直接计数法，操作步骤大致为：用无菌吸管吸取少许适当稀释后的酵母菌液，从计数板盖玻片一端注入，菌液渗入其中后静置几分钟，用吸水纸吸去多余菌液，最后显微镜观察计数。通常取血细胞计数板5个中方格的总菌数再求得每个中方格的平均值，该值乘上25或16就得出整个大方格中的总菌数，然后再换算成 1 mL菌液中的总菌数，即 1 mL菌液中总菌数=A525104B（以25个中方格计数板为例，A为总菌数，B为稀释倍数）。菌种分离1

15、2：稀释涂布平板法：吸出 0.1 mL稀释后的菌液于培养皿中，使用玻璃涂棒均匀涂抹在固体培养基上。平板划线分离法：使用接种环挑取悬液一环在培养基上划线分离，完毕后，盖上培养皿盖。上述操作均在无菌环境下进行，20 温室培养 4 d - 5 d，获得单个菌落。观察比较菌落的不同特点并编号。保存4：采用冰箱保藏法或石蜡油封藏法保存菌种。菌种鉴定：翻阅文献，对照菌种的相关特征然后归类。2.2 山楂汁的制作市售山楂鲜果，产地为山东烟台。选取其它实验材料和仪器为山楂果、果胶酶、打酱机、恒温水浴锅、加热锅、离心机、烧杯。取鲜山楂果若干，经清洗后选择完好无损、成熟饱满、色泽鲜亮的果子加1 : 1（w/v）水，

16、并加热 100 保温 1 min- 5 min或煮沸 5 min - 8 min，其中经过预煮程序能使山楂充分吸水，破坏山楂中的酶成分，防止固有营养成分的分解。然后打浆、冷却至 45 左右，加入 6 U/mL - 10 U/mL果胶酶，混匀保温酶解 6 h，最后离心得山楂汁。经消毒灭菌后，常温或低温密闭保存。3 实验方法3.1 山楂汁的降酸发酵在第6次富集转接培养时，每天测定总酸，培养 5 d - 6 d，记录富集培养基中各培养基中总酸的变化情况。取 50 mL和 100 mL的山楂汁各一份分别倒入 250 mL相同规格的锥形瓶作为一个实验小组，然后将分离纯化培养后的其中一种酵母菌接种到这两瓶

17、山楂汁中，室温下， 80 r/min摇瓶培养 14 d左右，测定山楂汁中柠檬酸的变化情况。取4种等量不同种类的菌液，分别接种在 250 mL相同规格的锥形瓶 100 mL的山楂汁中，室温下，80 r/min摇瓶培养 5 d - 6 d，测定山楂汁中黄酮的变化情况。3.2 柠檬酸的测定采用酸碱滴定法测定13,14：0.1 mol/L NaOH标准液的配制：用小烧杯在电子天平上称取固体氢氧化钠 4 g，加 100 ml蒸馏水，待氢氧化钠完全溶解，冷至室温后倒入 1000 mL容量瓶，加水至刻度，摇匀，备用。然后用配好的氢氧化钠标准溶液滴定邻苯二甲酸氢钾水溶液至微红色，且半分钟内不褪色为止。记录消耗

18、氢氧化钠的毫升数和使用邻苯二甲酸氢钾的克数并计算氢氧化钠溶液的当量浓度，保存标液。用移液管取 1 mL山楂汁样品于 250 mL锥形瓶中，加入 10 mL去离子水稀释，加2滴至3滴酚酞指示剂。用已标定的氢氧化钠标准溶液滴定样品至微红色且半分钟内不褪色为止。记录氢氧化钠标准溶液消耗量。以中和样品中柠檬酸为标准，计算柠檬酸的含量。采用高效液相色谱法测定15-17：流动相：使用超纯水（电阻率 18 M/cm2）配制成 2.50 %磷酸二氢铵溶液，并用浓H3PO4调pH至2.50，然后用 0.45 m的纤维素膜进行超滤，超声波脱气。标准有机酸溶液的配制和标准有机酸图谱的制作：标准有机酸采用柠檬酸、酒石

19、酸、草酸、乳酸、苹果酸、乙酸，分别用流动相配制成浓度为 50 mg/L，1000 mg/L，1500 mg/L，2000 mg/L，2500 mg/L的标准样品溶液并配制浓度分别为15000 mg/L，20000 mg/L，25000 mg/L，30000 mg/L，35000 mg/L的柠檬酸标准样品溶液。然后制作单一酸的标准峰图和混合酸的标准峰图。样品处理：精确吸取 2 mL样品后，用 7.5 mL 95 %乙醇沉淀大约 2 h，超声 30 min后，以 3000 r/min离心 10 min，取上清液 5 mL置于干燥箱里在 60 下直至乙醇完全蒸发，取出干燥后表面皿，加入 1 mL流动

20、相，将固形物全部洗下之后，经微孔滤膜（0.45 m）超滤利用高效液相色谱仪进行测定。色谱条件：色谱柱选用Phenomenex prodigy 5 ODS3 100A( 250 mm 4.60 mm i.d.， 5 m)；流动相的流速为 1 mL/min；柱温为 18 - 20 ；紫外检测波长为 210 nm；进样量为 5 L。3.3 黄酮的测定黄酮标准曲线的制作方法18：准确称取 50.1 mg干燥好的芦丁标准样品，定容于 50 mL容量瓶中，分别吸取 0.0 mL，0.5 mL，1.0 mL，1.5 mL，2.0 mL，2.5 mL，3.0 mL，3.5 mL， 4.0 mL，4.5 mL，

21、5.0 mL，5.5 mL，6.0 mL，6.5 mL定容后的芦丁标准品于 50 mL容量瓶中，首先加 5 %的亚硝酸钠溶液 2.0 mL，均匀混合后放置 6 min；然后加 10 %的硝酸铝溶液 2.0 mL，均匀混合后放置 6 min；再加入 1 mol/L的氢氧化钠溶液 10 mL，最后加水定容至刻度，摇匀，放置 15 min， 3000 r/min离心 10 min，取上清液于 510 nm处测定吸光度值。对黄酮含量与吸光度的对应数值进行回归，回归方程为W=3.9508x-0.0667。其范围是 0.0 mg/mL - 12.0 mg/mL，线性关系R=0.9972。山楂汁中黄酮含量计

22、算：吸附山楂汁 1 mL，加入 5 mL 95%的乙醇，置于超声波清洗器中 30 min， 3000 r/min离心 10 min，取上清液 1 mL，置于 50 mL容量瓶中，以下操作同标准曲线，测得山楂汁吸光度A，根据标准曲线回归方程计算黄酮的含量。4 实验结果分析与记录4.1 菌种的筛选分析在实验中，鉴于实验要求筛选出的酵母菌的天然生存环境和生活方式，我们选取了天然新鲜水果的部分表皮组织用来筛选可降酸的酵母菌菌种，获得了几种目的菌种，果皮用保鲜膜覆盖保存。总结成功获得酵母菌菌种的原因有以下4点：（1）天然水果皮上含有丰富的有机物，如糖类、蛋白质、无机盐、有机酸等，是微生物生长繁殖的理想环

23、境。（2）水果外表皮与空气接触，便于筛选在有氧环境下能充分降解柠檬酸的菌种。虽然多数酵母菌是兼性厌氧型微生物，但是与无氧环境相比有氧环境生命活动更旺盛，有机物利用更完全。（3）每种果树生长的自然环境和分布情况不同，因此，不同种类水果皮上附着的微生物有很大的区别，所以选取的水果种类越多，菌种资源越丰富。（4）实验材料来源广泛，简单易采集，便于重复筛选，获得更多的菌种。4.2 酵母菌的富集培养分析富集培养基是根据待分离微生物的特点设计的培养基，用于从环境中富集、分离某种微生物的培养基。其筛选菌种的方法区别于选择培养基，是使目的菌种在培养液中相对于其它菌种生长快，因此菌体数量明显增多，因富集而占优势

24、并逐步引向纯培养的一种培养技术。使用富集培养基的主要优势在于免去了选择培养基的选择再富集的复杂实验操作步骤，节省时间、器材、药品和简化操作程序，在将菌种培养到一定的时间之后就可直接进入菌种的分离培养阶段。在培养基成分的选择可参阅文献得到山楂汁中总酸的含量为 19.6 g/L，其中柠檬酸的含量为 16.37 g/L，占总酸含量的 83.5 %。为了获得能够在山楂汁中同化高浓度柠檬酸的酵母菌菌种，富集培养基中柠檬酸的含量应控制在 20 g/L，且以柠檬酸作为酵母菌生长代谢途径中的唯一碳源，培养基主要成分为葡萄糖-蛋白胨-酵母膏等。在pH值的确定时应选择等于或者低于山楂汁pH值 2.95 的培养基，

25、目的是筛选耐酸的酵母菌菌种，而本实验配制中有柠檬酸，pH值为 2.5 因此不用调整。培养基中总酸的变化见表1表1 富集培养总酸的变化（g/L）Tab 1 Change of total acidity by enriched culture（g/L）天数样品1样品2样品3样品41d20.0020.0020.0020.002d16.5217.6420.0020.003d9.8014.1411.6219.744d4.207.633.502.805d3.856.652.872.73由表1中可以看出，在培养的过程中，总酸含量是随着时间的增加而减少的。在 5 d之内，培养基中总酸由原来的 20.00 g

26、/L下降到 7 g/L以下，甚至某些样品到 3.00 g/L左右。说明培养基中含有能够利用柠檬酸作为碳源的酵母菌。而实验的目的就是筛选出这几种能够降酸的酵母菌。因此，通过分离、纯化能够达到我们的要求。图1 富集培养总酸的变化（g/L）Fig 1 Change of total acidity by enriched culture（g/L）图1是根据表1的总酸变化而作的图形，形象的反映了酵母菌富集培养 5 d的降酸过程。在 1 d - 2 d内，总酸下降较缓慢，首先由于菌种处于停滞期，需诱导产生能够利用柠檬酸发酵有关的酶系，其次菌种数量较少，柠檬酸的消耗量很小，因此利用率较低，图中曲线较平缓。

27、在 3 d - 4 d内，总酸下降幅度较大，原因是菌种开始大量繁殖，菌体数量大幅度增加，而加快了柠檬酸循环整个过程，并且随循环次数递增，底物柠檬酸含量与菌体数量达到平衡状态，柠檬酸有规律的减少。在 4 d - 5 d时，总酸含量趋于稳定，主要原因是菌种数量已达饱和或者开始有下降的趋势，其中有很多因素开始制约降酸的进行，如营养物质、pH值、代谢产物、菌种自身的生长状态等。所以应以 5 d为观察期限记录酵母菌富集培养降酸的全过程，超过这一范围，柠檬酸的含量基本保持不变，利用率几乎很小。4.3 山楂汁的降酸发酵分析4.3.1 柠檬酸分析实验小组选取了 50 mL和 100 mL的山楂汁接种相同品种的

28、酵母菌作对比分析，数据记录如下表2所示。表2 50 mL和 100 mL样品山楂汁降酸（g/L）Tab 2 Degrade the acid of 50 mL and 100 mL hawthorn juice（g/L）天数50mL100mL031.0037.00131.0037.00230.3836.40329.4037.10428.7037.10529.0037.10628.0036.40727.4936.30815.5433.8199.6630.80108.3329.47115.6025.90124.9023.80不同体积摇瓶培养的山楂汁的降酸能力有很大区别，影响降酸的因素有很多，以下是

29、每个因素的具体分析：（1） 溶氧量：本实验筛选的是在有氧条件下发酵柠檬酸的酵母菌，而摇瓶培养的目的就是增加酵母菌微生态环境的溶氧量。在相同形状等体积的锥形瓶中， 50 mL山楂汁与空气的接触面必然大于 100 mL山楂汁与空气的接触面，因而 50 mL溶氧量多， 100 mL溶氧量少。酵母菌在培养液中的分布也有所不同，需氧型的菌种分布在培养液的上层，兼性厌氧型主要分布在培养液的中层，但在上、下层均有分布，厌氧型则分不在下层。当菌种数量相同时，上层培养液的液面越小，需氧型酵母菌的分布越密集，对于氧的消耗量更加明显。因此，在自身溶氧量不足的情况下，如果耗氧量增加，它的降酸能力显然应下降。（2） 生

30、长时期：酵母菌的生长同其它微生物一样都要经历4个阶段，调整期、对数期、稳定期、衰亡期。其中，调整期使其适应酸性环境；对数期的菌体生长活跃，代谢水平处于很高的标准，这一时期柠檬酸等有机碳源的利用率很高，为菌体提供大量的能量和细胞生长物质；稳定期也能高效利用有机酸进行各种代谢产物的生产；衰亡期，菌体数量开始呈现负增长，生理结构也发生相应的变化，营养物质利用率相对较低，因此此阶段总酸变化保持在相对稳定的状态。（3） 菌龄：菌种传代次数越多，母体衰老程度越大，代谢能力越弱，物质利用越不完全。（4） 营养物含量：理想的环境条件下，随菌体数量的增加，降酸效果应越显著，但是在实验条件等有限的资源下，降酸程度

31、应受到底物的制约。因此，营养物质消耗量越多，菌体的生长环境越恶劣，菌体就越早进入衰亡期，由（2）可知衰亡期的降酸效果差。其次，营养物质比例的失调，例如C/N比值不合适等也可以影响酵母菌生长代谢。（5） pH：微生物须在适宜的pH值下才能生存，当pH值变化的时候，某些微生物的代谢方式也会发生变化。特别是在微生物发酵时，pH值的改变有可能引起产物的变化，对物质的利用跟预期的有所差异。在柠檬酸的降解过程中，pH值会逐渐升高，酸性环境一旦改变，酵母菌降酸能力也会随之改变。（6） 温度：在只有温度的影响下，高于或低于最适生长（或发酵）温度，微生物的生长（或发酵）受抑制。温度主要影响微生物自身酶的活性,高

32、温使酶变性失活，低温则抑制酶的活性。（7） 氧化还原势。分析以上因素后，将 50 mL和 100 mL山楂汁总酸变化情况用图表示不难理解曲线的变化规律。图2 50 mL和 100 mL样品山楂汁降酸Fig 2 Degrade the acid of 50 mL and 100 mL hawthorn juice由图2很容易看出 50 mL相对于 100 mL山楂汁，降酸能力明显。具体情况为：（1）0 d- 7 d，50 mL和 100 mL山楂汁中酵母菌的生长状况相似，柠檬酸含量保持在一定的水平上。柠檬酸的同化量较低。（2）7 d以后，50 mL和 100 mL山楂汁中柠檬酸含量开始大幅度下降

33、，其中 50 mL的降酸速率为 2.175 g/(Ld)，100 mL的降酸速率为 1.100 g/(Ld)。50 mL的下降速率远高于 100 mL的下降速率。由影响酵母菌降酸的诸多因素可得，溶氧量越多，底物越多，pH值、氧化还原电势越适宜，菌种生长状况越好，降酸效果最佳。4.3.2 黄酮分析下图3为实验所作的黄酮含量的标准曲线，由分光光度计测得的吸光度值可以通过查表得出黄酮的含量。因此，经计算得出山楂汁降酸发酵前黄酮的含量为 2.572 g/L。图3 黄酮标准曲线Fig 3 Flavonoids standard curve不同品种酵母菌降酸时各情况的变化记录情况如下表所示：表3 样品1酵

34、母菌降酸情况Tab 3 Sample 1 yeast degrades acid样品1天数酸（g/L）pH温度黄酮（g/L）215.403.0317.52.57239.803.1917.71.69548.403.3418.52.50555.603.3617.52.46565.643.3920.72.229表4 样品2酵母菌降酸情况Tab 4 Sample 2 yeast degrades acid样品2天数酸（g/L）pH温度黄酮（g/L）116.603.0318.32.549213.303.0517.71.834310.853.1318.42.57247.703.2417.52.56056.

35、163.3119.32.300表5 样品3酵母菌降酸情况Tab 5 Sample 3 yeast degrades acid样品3天数酸（g/L）pH温度黄酮（g/L）216.803.0318.32.55339.803.0818.41.69946.163.1318.42.57256.043.2319.72.46265.743.2619.12.205表6 样品4酵母菌降酸情况Tab 6 Sample 4 yeast degrades acid样品4天数酸（g/L）pH温度黄酮（g/L）216.803.0517.72.56439.453.1517.71.61646.763.1819.22.4665

36、6.163.2321.02.46266.163.2521.02.189根据以上黄酮含量的变化可作变化曲线，能够明确的得出黄酮的波动规律。具体情况如下图所示：图4 黄酮含量的变化曲线Fig 4 Flavonoids change curve分析图4可得出4个样品中的黄酮含量在山楂汁降酸发酵 5 d - 6 d过程的变化范围均在 0.040 g/L - 0.070 g/L之内。排除温度和pH值的影响，黄酮含量波动的范围很小，4个样品黄酮的保留率分别为 89.2 %，91.9 %，89.4 %，87.8 %。因此黄酮在发酵的过程中能够保持较稳定的状态。实验证明这4种样品的酵母菌均为可降酸且保留黄酮的

37、菌种。4.3.3 高效液相色谱图分析本实验小组使用了样品2作高效液相色谱图分析。表7 各种酸的标准峰面积范围Tab 7 Various acid standard peak area range种类峰面积范围草酸3.091-3.097酒石酸3.958-3.960苹果酸5.723-5.725乳酸6.657-6.655抗坏血酸7.225-7.246柠檬酸14.825-14.869琥珀酸15.454-15.435利用高效液相色谱法作出了样品2中各个种类酸含量随时间变化的色谱图，其中图1为原液的高效液相色谱图。图2至图4记录了在 84 h之内5个不同阶段的的酸变化。由表7中酸的标准峰面积范围可以得到山

38、楂汁中柠檬酸的峰面积范围，然后在高效液相色谱图中观察柠檬酸的变化。图5 原液峰图Fig 5 Bioburden of peak figure图6 样品2发酵 12 h峰图Fig 6 Sample 2 peak figure of 12 h图7 样品2发酵 24 h峰图Fig 7 Sample 2 peak figure of 24 h图8 样品2发酵 48 h峰图Fig 8 Sample 2 peak figure of 48 h图9 样品2发酵 72 h峰图Fig 9 Sample 2 peak figure of 72 h图10 样品2发酵 84 h峰图Fig 10 Sample 2 pe

39、ak figure of 84 h使用发酵峰图的注意事项：（1） 发酵的有些酸在峰图中的位置可能会出现提前或者延后的现象。造成此现象的原因是：山楂汁的样品在沉淀时放置的时间不够或者取样时混有少量杂质，干扰了系统的识别。（2） 峰图上某些位置会有两种或者两种以上种类的酸的峰面积出现重叠，在看图时应仔细区分不同种类酸的差异。由以上6个图可与看出柠檬酸随时间的推移峰面积在逐渐的减小。这些图的变化说明了，随着发酵的进行，柠檬酸的含量是逐渐降低的。图11 样品2发酵酸值变化曲线Fig 11 Sample 2 acids change curve由图11中酸值变化情况可以看出总酸含量是随着柠檬酸含量的变化

40、而变化的，因为总酸中柠檬酸的含量的比例很大所以，柠檬酸的下降速度与总酸的下降速度很接近。在 72 h到 84 h是柠檬酸的降解速度已经为 0 。说明样品2山楂汁中的酵母菌在发酵前期能够充分利用柠檬酸，因此此菌种可作为山楂汁降酸的菌种之一。4 实验结果（1） 从山楂汁的分离筛选实验中，通过使用酵母菌选择培养基成分和以柠檬酸为主的低酸性环境，我们从天然的水果皮当中找到了能够降低总酸及柠檬酸含量且保留黄酮的几种酵母菌菌种，这几种菌种均为目的菌种，对山楂汁中柠檬酸的利用率都很高。编号分别为样品1、样品2、样品3、样品4。（2） 在山楂汁的酵母菌降酸实验中，我们分别研究了样品1、样品2、样品3、样品4在

41、发酵过程中各山楂汁的有机成分的变化。并通过各指标的比较分析，我们获得的降酸过程中比较重要的数据如柠檬酸、黄酮的含量变化，利用这些数据，我们能更好的控制发酵。（3） 降酸的意义首先是利用降酸后的山楂汁，能生产出更多为人们饮食、健康所接受的食品。其次是利用微生物学的方法，为水果果汁的制作提供更多的研究材料，便于果汁深加工这方面的探索。5 结 论山楂汁的微生物降酸是降解山楂汁中有机酸的其中一种方法19。该方法通过对微生物的筛选与分离，找到了能够降解柠檬酸的酵母菌。微生物降酸还为山楂汁的降酸提供了另一种思路。传统意义上的降酸只是物理化学方面的尝试而采用微生物方法，通过对降酸微生物生理生化方面的控制，能

42、够灵活的掌握降酸的各个环节且能够从山楂汁的风味、色泽、口感等多个方面进行改善。在这几个方面，降酸最大的优势就在于能够相当程度地改变山楂汁的口感，由此拓展出更加广阔的发展空间。致 谢本文从论文的选题、实现条件以及论文的写作阶段都是在副教授的精心指导和实验小组的共同努力下才完成的。在这篇论文完成之际，首先要感谢我亲爱的母校烟台大学为我们提供了良好的学习氛围和优良的实验设备和实验条件，为我们在学习专业知识中奠定了坚实的基础。然后要感谢老师的悉心指导和谆谆教诲，您严谨的科学态度和敬业精神使我们受益匪浅，同时也要感谢宋继萍学姐对我们实验的帮助和指导。其次要感谢实验小组贾丽、李星、方晓同学，勤奋、努力、刻

43、苦专研的学习态度和互帮互助的精神。最后要感谢生我养我的父母和我们223宿舍的全体舍友，你们在生活上时刻都帮助和照顾我，使我备受鼓舞。谢谢你们！参考文献1 高光跃，冯毓秀山楂属植物研究概况国外医药植物药分册，1994.9(2):56-602 Abdelaaty A S，Faiza HAnti-complementary activity of Crataegus sinaicaPlanta Med，1992，62:10-133 阚建全食品化学M北京：中国农业大学出版社，3164 北京卫生防疫站，中国预防医学科学院营养与食品卫生研究所，北京市食品工业协会，食物营养成分表M中国轻工业出版1990:4

44、35 Ammon H P T，Hadtoxicology and plarmacologyMIIIToxicityPlant Medical，1981，43:313-3226 Buchanan RE，Gibbons NEBergeys manual of determinative bacteriologyMBaltimore：The Williams & Wilkins company，1974:702-7087 余伯良发酵饲料生产与应用新技术M北京:中国农业出版社，1999:2868 徐凤华，孙冬梅，宋金柱微生物制品技术及应用M北京：化学工业出版社，2007:223-2319 周德庆微生物

45、学教程M，第二版北京：高等教育出版社，2002:47-52,243-24410 Cletus PKurtzman WThe Yeast，A Taxonomic StudyMElseriver AmsterdamLausanneNew YorkOxfordShannonSingaporeTokyo，199811 沈萍微生物学M，第一版北京：高等教育出版社，2000:368-37012 沈萍，陈向东微生物学实验M，第四版北京：高等教育与出版社2007.11:28-34，51-5613 吴谋成食品分析与感官评定M北京：中国农业出版社，2002.7:54-5514 大连轻工业学院，华南理工大学等食品分析M北京：中国轻工出版社，1995:130-13315 王玉君等高相液相色谱法分析色酒中有机酸的研究J1991.9(4):27116 崔雨林，戴蕴清，韩雅珊高效液相色谱法测定水果及其果汁中的集中有机酸J北京农业大学学报，199