第7章生物物理技术纳米探针技术.doc

1、纳米探针技术摘要：随着纳米技术的发展及微创检测的需求，一种探头尺寸仅为纳米量级、探测单个活细胞的技术-纳米探针技术应运而生。本文将介绍三类材料纳米探针半导体类（量子点，光子晶体）、金属类（胶体金）及纳米磁颗粒类在生物、医学等领域的应用。目录1.半导体类21.1 量子点21.1.1 量子点的基本组成结构及其光学特性21.1.2 量子点在生物学方向应用21.1.3 量子点在医学方向应用31.2 光子晶体41.2.1 晶体的基本组成结构及其特性41.2.2光子晶体分类及应用42 金属类52.1 胶体金52.1.1 胶体金的制备及其特性52.1.2 胶体金在生物学方向应用52.1.3 胶体金在医学方向

2、应用62.2.1 纳米磁颗粒类的基本组成结构及其特性72.2.2 纳米磁颗粒在生物学方向的应用72.2.3 纳米磁颗粒在医学方向的应用7纳米材料是指三维空间中至少有一维的尺度在1-100纳米范围的材料，它们具有以下基本特征：1.量子尺寸效应，2.小尺寸效应，3.表面效应，4.宏观量子隧道效应。纳米探针主要有三种类型：半导体类（量子点，光子晶体）、金属类（胶体金）及纳米磁颗粒类，它们在生物、医学等领域有广泛的应用。对“1.量子尺寸效应，2.小尺寸效应，3.表面效应，4.宏观量子隧道效应。”做出解释1.半导体类1.1 量子点1.1.1 量子点的基本组成结构及其光学特性量子点又可称为半导体纳米微晶体

3、(Semiconductor nanocrystal)，是一种由-族(CdSe 、CdS 等) 或-族( InP、InAs) 元素组成的粒径小于100 nm 的半导体纳米微晶体。由于量子点粒径很小(约1100 nm)，电子和空穴被量子限域,连续能带变成具有分子特性的分立能级结构,因此可以发射荧光。和传统荧光基团相比较,量子点有较高的荧光强度,较强的抗光漂白能力和较窄的发射光谱,具有良好的光化学稳定性,可耐受更强的激发光和更长的光发射周期。量子点优良的光学性质使其许多生物医药研究领域中有着广泛的应用。1.1.2 量子点在生物学方向应用 量子点主要应用于生物传感器和生物芯片。MitchellMic

4、halet X，et al，2005用巯基丙酸修饰ZnSCdSe量子点，然后分别将3，或5，巯基衍生的2段不互补的DNA固定到量子点上，制得2种DNA功能化的量子点，再将它们和与这2段DNA互补得DNA片断混合，即可进行杂交组装。将ZnSCdSe量子点与检测抗体连接，然后采用非均相夹心法在微阵列芯片上形成抗体-抗原-检测抗体结合体，用激光共聚焦扫描检测这一结合体的荧光信号，可以实现微阵列芯片上的免疫分析(见图1)。图1Han等Han M，et al，2001 和他的同事巧妙地将不同数量、不同荧光特征的量子点组合进内部镂空的高分子小球中，从而形成具有不同光谱特征和亮度特征的可标记到生物大分子上的

5、微球。他们在模型实验中利用这些微粒在混和的DNA试样中进行检测，实验证实了量子点作为探针用于检测DNA遗传序列具有可行性。同时还发现，只需要56种颜色结合6种发光强度的纳米粒子进行不同组合，得到的纳米粒子微球就可以形成1000040 000个可识别的编码。如果发光强度的变化增加到10种，就可以提供100万个可识别的编码，理论上可以对100万个不同的DNA或蛋白质进行编码（见图2）。图2事实上，如要达到精确的检测、不带有任何光谱交叠，可编码的纳米粒子微球应当可以达到1万到4万种。根据人类基因组测序草图，人类具有的基因不超过40 000个，该技术可对所有这些基因进行编码。因此，量子点在生物传感器及

6、生物芯片领域具有广泛的应用前景。1.1.3 量子点在医学方向应用 量子点主要应用于肿瘤细胞检测、活体示踪和药物的含量测定。Akerman 等Han M，et al，2001将肽与量子点结合用于标记特定组织部位的内皮细胞受体，通过静脉注射将连有肽片段的量子点注入到小鼠体内,可以观察到量子点在特定的目标组织部位聚集,从而实现活体示踪（见图3）。图3量子点极高的灵敏度使其在药物含量测定中渐显优势,基于量子点的荧光猝灭法、荧光增敏法对药物进行定量测定屡见报道。Liang 等L IANGJ G，et al，2006基于安体舒通与CdSe 量子点作用发生荧光猝灭而建立测定安体舒通含量的方法. 在最佳条件下

7、,安体舒通浓度与量子点荧光强度在2. 5700 g /L 范围内呈线性相关,相关系数达到0. 997，检测限为0. 2 mg/L. Liao 等L IAO Q G ，et al，2007 将水溶性的CdS 量子点用巯基乙酸包覆,通过阿霉素与其作用引起的荧光猝灭建立了含量测定方法. 在Brit ton Robinson 缓冲液中(p H 值为7. 00)，阿霉素对CdS 量子点的猝灭很弱,不能直接用于阿霉素的测定. 加入阳离子表面活性剂如十六烷基三甲基溴化铵后,阿霉素可与量子点通过静电作用相结合,形成一种新的化合物,使猝灭强度显著增加,实验结果理想,检测限达到10-9mol/L. Sukhano

8、va等Sukhanova A，et al，2004用QDs对乳腺癌细胞膜上的P一糖蛋白(PgP)进行三维共聚焦分析。PgP过度表达于MCF7r乳腺癌细胞膜，介导多药耐药性（muhidrug resistance，MDR)表型的形成，可作为MCFTr细胞的特异性靶点将抗Pgp抗体作为一抗，QDs结合多价二抗与之结合进行荧光成像。这种结合具有很高的特异性，用不表达膜PgP的MCF7细胞作为对照时发现无明显荧光信号。进一步的对照实验将细胞不先与一抗结合而直接结合二抗，结果无明显荧光信号也充分证明这一点。通过该技术完成的乳腺癌细胞膜PgP三维重建的图像清楚显示了过度表达的PgP在乳腺癌细胞膜上的分布情

9、况 其效果远远优于FITC、Alexa Fluor等其他荧光染料，这为乳腺癌的分子生物学研究提供了最直观的依据。1.2 光子晶体1.2.1 晶体的基本组成结构及其特性光子晶体是一种介电常数随空间周期性变化的新型光学微结构材料，可控制光子的运动，是光电集成、光子集成、光通信的一种关键性基础材料。光子晶体具有以下基本特征：1. 光子禁带：光子晶体最根本的特性,频率落在禁带中的电磁波,无论其传播方向如何,都是禁止传播的；2. 光子局域：在无序介电材料组成的光子晶体中,光子呈现很强Anderson局域。如果在光子晶体中引入某种程度的缺陷,则和缺陷态频率相吻合的光子有可能被局域在缺陷位置。一旦其偏离缺陷

10、处,光就迅速衰减；3. 偏振特性：二维光子晶体对入射电场方向不同的TE、TM两种偏振模式的光具有不同的光子禁带。1.2.2光子晶体分类及应用 由于光子晶体中折射率在空间上必须为周期性的函数，我们可将光子晶体分为：一维、二维以及三维。1.2.2.1 一维光子晶体应用：发光二极管（LED） 利用光子晶体对自发辐射的控制作用,并使受控制的自发辐射按照引导波导发光,可得到高效的发光二极管。LED是利用化合物半导体（主要是III-V族化合物半导体）中电子由高能级至低能级与空穴复合时释放出电子，且能量（能量级差）大小不同，产生光的频率和波长也不同的原理，直接发出人眼可看到的红、橙、黄、绿、蓝等颜色的可见光

11、及近红外、紫外的不可见光。由于LED具有反应速率快、耐震性好、单色性佳、具有衰减性等特点，可用作手术无影灯的点光源，在医学领域有很好的发展前景11。1.2.2.2 二维光子晶体应用 二维光子晶体主要应用光子晶体激光器。光子晶体激光器的制备是在第三维的方向上用镀膜或全内反射的方法形成禁带。如果在光子晶体二维周期结构中人为地制造出一个点缺陷，在光子带隙中就会出现一个或数个孤立的缺陷模。激发微腔内的激光介质就会产生具有缺陷模特征的激光。当微腔的Q 值足够地高时，缺陷模激光就会有很好的单色性。以平面内波导或平面外其它方式将缺陷模激光引出光子晶体，缺陷模激光的方向就可以很好地加以控制（见图4）。图419

12、99年美国加州理工大学AScherer领导的研究组在Science期刊首次报道了可工作在室温状态下且运转在1.55m的光子晶体激光器。光是由两种不同机制束缚于光子晶体中心的微腔的。首先由几层高折射率的介电板与空气界面构成竖直方向的全内反射光束缚层。其次在中间的介电板内刻蚀出六角排列的空气柱，构成二维光子晶体。周期折射率的变化导致光子在平面内产生布朗格散射，形成色散关系中的禁带。2001年日本的研究人员发展了一种用光子晶体的不对称元胞结构控制半导体激光偏振性的技术，发表于Science期刊。实验中半导体激光区域置于用光子晶体做的衬底上，激光波长正好与光子晶体能带的一高对称点的频率相对应。随着刻蚀

13、技术的进步光子晶体激光器件将日臻完善。1.2.2.3 三维光子晶体应用：光子晶体光纤（PCF）关铁梁，2002 PCF 是由单一材料和周期性排列其中的沿轴向均匀的空气孔构成的新型光纤，其空气孔的直径为波长量级。它具有以下特性：1、无休止单模传输特性；2、模场有效面积可控特性；3、色散可控特性；4、双折射可控特性。基于以上特性，PCF可用于增加未来波分复用系统信道数；制作符合DWDM全光通信网要求的全光开关、光波长转换器、全光2R 再生器等多种器件，还可以为许多量子通信系统提供纠缠光子源；实现可见光波段孤子的产生与维持，在低于传统光纤三个量级的脉冲峰值功率下产生光谱覆盖紫外到红外的超连续光等。2

14、 金属类2.1 胶体金2.1.1 胶体金的制备及其特性胶体金是氯金酸的水溶液，是氯金酸在还原剂如白磷、维生素、抗坏血酸钠、构椽酸钠和鞣酸等的作用下， 聚合成特定大小的金颗粒，并由于静电作用成为一种稳定的胶体状态，故称之为胶体金。通过改变反应体系中氯金酸与还原剂的比例即增加或减少还原剂的量可得到所需不同直径的金颗粒。不同尺寸的胶体金在光照下有不同色彩，这种强烈色彩是由于表面等离子体共振（SPR）引起的（见图5）。图5胶体金颗粒在弱碱性环境中带负电荷，可与蛋白质分子的正电荷基团因静电吸附而形成牢固结合,即免疫胶体金。由于这种结合是静电结合，所以不影响蛋白质的生物特性房曦菁等，2001。此外胶体金还

15、可以与许多其它生物大分子非共价结合。2.1.2 胶体金在生物学方向应用胶体金主要应用于生物超敏检测和基于SPR、拉曼光谱检测的探针技术。采用夹心法将胶体金与特异性抗原或寡核苷酸结合，形成胶体金探针。检测时，如待测物中含有抗体或寡核苷酸，利用抗原抗体的特异性结合或碱基互补配对原则，胶体金在待测物周围发生聚积，导致胶体金尺寸变大。单分散的免疫金溶胶呈清澈透明的溶液，当出现凝聚后，溶胶颗粒极度增大，光散射随之发生变化，颗粒也会沉降，溶液的颜色变淡甚至变成无色，这一原理可定性或定量地应用于免疫反应。这一反应也可以通过银颗粒的沉积被放大，称之为免疫金银染色（见图6）。图6这种方法可以检测到微量的生物分子

16、。超瑞利散射技术(HRS) 比其他光学技术敏感度要高出12 个数量级,在纳米金溶液中HRS信号强度可提高105 倍,能够用来对寡核苷酸链的单碱基错配进行超敏感检测,而不用对DNA 作任何修饰. 完全互补的靶序列导致纳米金聚集使HRS 信号显著增强,而有碱基错配的HRS 信号基本没有改变. 如果进一步优化该系统,通过改变纳米金的形状和粒径来增强HSR 信号,可以将灵敏度再提高几个数量级。2.1.3 胶体金在医学方向应用胶体金主要应用于免疫胶体金( ICG)技术和银染色。免疫胶体金技术最初仅用于免疫电镜技术,现已发展到被动凝集试验、光镜染色、免疫印迹、斑点金免疫渗滤法以及免疫层析技术等蒋韬等，20

17、08。胶体金免疫层析技术是20世纪90年代在免疫渗滤技术基础上建立的一种简易、快速免疫检测技术，由Beggs等最先用于人绒毛膜促性腺激素(HCG)的测定。它是在单克隆抗体技术、胶体金免疫层析技术和新材料技术基础上发展起来的严华等，2005。其原理是将特异的抗原或抗体以条带状固定于硝酸纤维素膜上的某特定区域(检测带)，胶体金标记另一特异的抗原或抗体，吸附于玻璃纤维上,然后固定于硝酸纤维素膜的某一特定位置作为胶体金结合垫。当干燥的硝酸纤维素膜一端浸到样品后，由于毛细作用,样品沿着膜向上移动，当移动至胶体金结合垫(金标垫)处时，如样品中含有待检物，则发生特异性免疫反应形成免疫复合物。继续前移至检测带

18、时，待测物和免疫复合物与之发生特异性结合而被截留在条带区域上，通过胶体金标记物而得到直观的显色结果。而游离标记物则越过检测带，与结合标记物自动分离赵海锋等，2007（见图7）。图7 ？吴英松等吴英松等，2002利用胶体金标记抗恶性疟原虫乳酸脱氢酶单抗制成诊断恶性疟原虫的免疫层析条,检测重组恶性疟原虫乳酸脱氢酶,其最低检测量为1 ng。李希友等李希友等，2006用20 nm胶体金标记新城疫抗原制成免疫层析试纸条,用于半定量快速检测新城疫抗体,检测结果与血凝抑制试验(H I)法测得结果的符合率为93.8%,其最小检测HI滴度为4log2,与其他病毒的阳性血清没有交叉反应,且室温下有效保存期为3个月

19、。纳米金还具有特殊的氧化- 还原能力,能够催化银离子在其表面被还原而发生沉积,形成“银染反应”,促使反应信号进一步提高106倍。金免疫技术的敏感度低于其它标记免疫技术，经银加强染色后敏感度可与荧光免疫技术和酶免疫技术相当。在以膜为载体的免疫技术（如免疫印迹法）中，也有应用IGSS以替代酶免疫法。也有用金标记抗体代替酶标记抗体进行类似ELISA的测定，最后进行银加强，其敏感度与ELISA相仿。2.2 纳米磁颗粒类2.2.1 纳米磁颗粒类的基本组成结构及其特性磁纳米颗粒为一种处于纳米级(1100nm)的磁性材料(Fe的氧化物为主)，当磁纳米颗粒粒径小于其超顺磁性临界尺寸时，粒子进入超顺磁状态,无矫

20、顽力和剩磁。它具有较低的居里温度，具有良好的磁导向性、生物相溶性和生物降解性等,可结合多种生物功能分子(酶、DNA、蛋白质等)。2.2.2 纳米磁颗粒在生物学方向的应用纳米磁颗粒主要应用于生物检测、生物分子分离、生物传感器。在纳米磁颗粒表面镶嵌具有生物活性专一性抗体或寡核苷酸,在外加磁场的作用下,利用抗原抗体的特异性结合或碱基互补配对原则,就可以得到免疫磁性颗粒,利用它们可快速有效的将细胞、核酸分离或进行免疫分析,磁性粒子这一独特性质，使其广泛应用于生物分离工程中，如磁性粒子可应用于细胞分选、蛋白质纯化、酶的手性拆分等领域。何晓晓等何晓晓等，2003将超顺磁性DNA 纳米富集器应用于痕量寡聚核

21、苷酸的富集。通过在硅壳磁纳米颗粒表面修饰单链DNA 探针构建超顺磁性DNA 纳米富集器(见图8)。图8 将215 mg/mL 的链霉亲和素溶液(用10mmol/L pH= 7.10 的PBS 缓冲液配制) 加入到5mg 硅壳磁性纳米颗粒中, 在4 下恒温振荡培育24 h后, 用PBS 缓冲液洗涤颗粒3 次。用2% 的戊二醛溶液在室温下将吸附在纳米颗粒表面的链霉亲和素加以固定后, 再将生物素标记的ssDNA 探针修饰在硅壳磁纳米颗粒的表面, 即制备了超顺磁性DNA纳米富集器. 将10 mg 单链DNA 探针修饰的磁纳米颗粒悬浮在10 mL 杂交缓冲液中, 加入1 L荧光(TMAR ) 标记的目标

22、单链DNA， 在37 下振荡培育30min，完成单链DNA探针与目标DNA 的杂交反应。分别测量了荧光(TMAR ) 标记的互补单链DNA 在富集前后的荧光光谱，结果表明,上清液的荧光强度明显降低, 说明待测溶液中的荧光(TMAR ) 标记的互补单链DNA 已结合在DNA纳米颗粒富集器上。2.2.3 纳米磁颗粒在医学方向的应用纳米磁颗粒主要应用于磁靶向药物、磁疗、MRI。用于磁靶向药物的NP分为两种类型：一种称纳米球或毫微球(nanosp here)，有高分子基质骨架,药物分散于其中;另一种称纳米囊或毫微囊( nanocap sule)，属药库膜壳型，由高分子材料形成的外壳和液状(水或油状)

23、内核构成,药物通常被聚合物膜包封在内核层。NP 中的药物可通过沥滤、渗透和扩散或通过基质的溶蚀而缓慢释放出来。在肝癌(HCC)的靶向药物输送中，NP 对HCC 治疗的靶向性可分为被动靶向和主动靶向两种（见图9）。图9NP 的被动靶向性是指它容易被肝网状内皮系统(RES) 中的Kupffer 细胞吞噬而在肝脏内聚集,然后被包载的药物逐步释放入血液循环,使肝脏局部药物浓度增加,从而减轻对其他脏器的不良反应。主动靶向性是指对NP 进行表面修饰,如在其表面耦联特异性的靶向分子(特异性的配体、单克隆抗体等)，NP 可通过靶向分子与细胞表面特异性受体结合从而实现主动靶向治疗。以磁性纳米材料为微载体的纳米磁

24、控药物能选择性地准确定位于病变器官，具有明确的主动靶向效应, 在体外交变磁场作用下，纳米磁靶向药物载体产生磁滞、Nel松弛或诱导涡流等物理现象，使导入癌灶局部的磁粒产热，磁材的热传导到肿瘤细胞，达到一定温度后，能引起肿瘤细胞死亡。Moroz Moroz P. et al，2003通过对2Fe2O3 纳米粒悬浮在碘油经肝动脉栓塞治疗兔VX2 肿瘤模型的实验研究,证明癌铁的浓度是正常肝组织的513 倍,癌的温升率比正常肝组织高1115 倍,认为磁性纳米粒子对肝肿瘤的治疗是一种安全、有效的靶向热消融方法。随着纳米技术的飞速发展,NP 将在肝癌的治疗中发挥越来越重要的作用。特别是作为一种良好的基因载体

25、,NP 可有效解决目前基因治疗中载体所引起的免疫原性、安全性、低转染率和靶向性等诸多问题,具有广阔的应用前景超顺磁性Fe3O4（SPION）是一种新型的磁共振阴性对比剂，具有生物相容性、超顺磁性、纳米粒子表面效应。目前，SPION作为磁共振造影剂的研究热点，与以往采用的GD - DTPA 阳性MR 造影剂对比，SPION磁矩和磁化率大，是T2加权照影剂，阴性照影剂，缩短T2获得低MRI 信号,对T1影响较小，体内半衰期约10h，注射后0-3.5h均可行增强成像，且具有肝脏特异性，即主要由肝脏正常组织中的枯否氏细胞吞噬，而肿瘤组织由于缺乏该类细胞，使得SPION在肿瘤部位含量低，从而可通过磁共振

26、检测将正常与病变组织区分开来。如果将SPION固载抗肿瘤药物，可以同时实现疾病的早期诊断与治疗.参考文献1. Chan WC， Nie S. Quantum dot bioconjugates for ultrasensitive nonisotopic detection. Science， 1998， 281 ： 1 030 - 1 931.2. Han M， Gao X， Su J Z . Quantum - dot - tagged mi2 crobeads for multiplexed optical coding of biomolecules J . Nat Biotechno

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