《微生物学检验》实验指导书.doc

1、安徽医学高等专科学校校内自编教材微生物学检验实验指导书主编：杨勇麟编者：杨勇麟、刘萍、楼研、房功思、韩静医学技术系免疫及病原生物学教研室2009年5月目 录实验目的与实验室规则2实验一 显微镜油镜的使用和注意事项 3实验二 细菌的形态与特殊结构观察 5 实验三 细菌不染色标本的检查6实验四 细菌涂片的制备与革兰染色 7实验五 常用培养基制备11实验六 细菌的接种技术及培养方法20实验七 细菌生长现象的观察 24实验八 微生物的分布26实验九 生化反应培养基制备 27实验十 生化反应细菌接种29实验十一 观察分析生化反应结果 31实验十二 物理消毒灭菌法31实验十三 化学消毒灭菌法37实验十四

2、药物敏感试验 38实验十五 葡萄球菌鉴定41实验十六 甲型溶血性链球菌、肺炎链球菌鉴定 43实验十七 乙型溶血性链球菌、肠球菌鉴定45实验十八 大肠埃希菌与沙门菌 47实验十九 志贺菌、变形杆菌、克雷伯菌与产气肠杆菌49实验二十 非发酵菌检验51实验二十一 弧菌检验53实验二十二 厌氧性细菌54实验二十三 分枝杆菌与放线菌 57实验二十四 真菌检验62实验二十五 支原体、衣原体、螺旋体检验63实验二十六 病毒的形态观察66实验目的与实验室规则一、 实验目的实验是本课程的重要组成部分，其目的在于使学生通过实验，验证有关理论，加深对基本理论知识的理解；通过实验操作，学会有关的基本操作技能，建立无菌

3、观念和掌握无菌技术；通过正确地观察和分析实验结果，使学生养成实事求是、严肃认真的科学态度，培养学生独立工作和分析解决问题的能力，为今后学习其他课程和参加临床工作打下良好的基础。二、 实验室规则由于本门课的实验材料大多是病原微生物，如操作不慎发生意外，可能造成自身感染或污染环境，因此，必须严格遵守以下规则：1.进实验室要穿工作服，离室前脱下并反折，工作服经常清洗，保持清净。2.非实验用品不准带入实验室，必需的教材和文具带入后要远离操作部位。3.实验室内绝对禁止饮食、吸烟，不要用手抚摸头面部等。4.实验室内要保持肃静，禁止高声说话和乱动物品。5.实验中一旦发生意外，如划破皮肤、细菌污染桌面、地面、

4、手及衣物时，应立即报告老师及时处理。6.凡实验用过的污染物品及器械，如带菌吸管、试管、玻片、培养物等，应放入指定容器内，不得直接清洗或放在桌上。7.爱护公物，节约使用实验材料，如损坏实验器材，应向老师报告，酌情处理。8.实验完毕，按要求整理实验物品和桌面，打扫卫生，检查水电和门窗。9.离开实验室前，用肥皂洗手，必要时用消毒液泡手，然后离开实验室。 实验一 显微镜油镜的使用和注意事项一、实验目的1.掌握显微镜油镜的使用方法与注意事项。图1-1 油镜原理示意图2.熟悉油镜的原理。二、实验原理油镜的原理：玻璃的折射率(1.515)与空气的折射率(1.000)相差较大，因而当光线通过集光器进入物镜时，

5、由于折射而散失的光线较多，进入到物镜中的光线较少，导致视野昏暗，物象不清晰；而在标本玻片与油镜之间加香柏油代替空气，香柏油的折射率(1.520)与玻璃相近，当光线通过时，由于折射而散失的光线较少，进入到物镜中的光线较多，因而视野明亮，物象清晰。（见图1-1）三、实验材料普通光学显微镜、香柏油、二甲苯、擦镜纸四、实验方法1.使用油镜时，必须端坐，不要将镜台倾斜，以免镜油流出污染镜台。2.以自然光线为光源时，用平面反光镜，以灯光为光源时，用凹面反光镜。3.将载玻片标本放在载物台上，用移动器或固定夹固定好。先用低倍镜对好光线，然后转换油镜头，升高聚光器，把光圈完全打开。4.在标本上滴加1滴香柏油，从

6、侧面注视油镜，并缓慢将镜头下降至油内，但不要碰到载玻片，以免损伤镜头。5.以左眼注视目镜视野内，先用粗调节器使镜筒缓慢上移，调节至有模糊物像时，然后再用细调节器调至物像清晰，观察标本时，两眼应同时睁开，以减少眼睛疲劳。最好用左眼看镜筒，右眼配合绘图或记录。6.使用完毕，用擦镜纸（切不可用手、布或其他纸类）蘸少许二甲苯擦去香柏油，再用擦镜纸将残存的二甲苯擦干净。7.最后，将物镜转成“八”字形，反光镜竖起，下降聚光器和镜筒，罩好镜套，放入镜箱内。8.使用显微镜要轻拿轻放，平时放置要注意通风干燥，防霉防晒。【 注意事项 】 ( l ）使用显微镜时应小心爱护，不得随意拆卸。 ( 2 ）搬动显微镜时，用

7、一手持镜臂、一手托镜座平端。 ( 3 ）载物台要放平，以防滴加的香柏油流出玻片。 ( 4 ）玻片干后才能加香柏油，滴加时要避免气泡形成，香柏油要适量，不宜过多或过少。 ( 5 ）调节粗调节轮时，动作要轻，侧面观察镜头和玻片的距离，注意使镜头与玻片不要相碰。 ( 6 ）用擦镜纸擦拭油镜头时，注意手法要轻柔，并向同一方向拖拭，防止旋转擦拭，以免损伤贵重的油镜光学系统。五、思考题1显微镜油镜的原理是什么？2.简述油镜的使用方法？3.如果视野太亮或太暗，可以通过哪些方法来解决？实验二 细菌的形态与特殊结构观察一、实验目的1.掌握细菌的基本形态和特殊结构。2.熟悉油镜的使用。二、实验材料普通光学显微镜、

8、香柏油、二甲苯、擦镜纸、细菌基本形态及特殊结构示教片三、实验方法用油镜观察示教片，注意细菌的染色性、形态、大小、排列方式及特殊结构。（一）基本形态观察1.球菌 金黄色葡萄球菌、溶血性链球菌、脑膜炎奈瑟菌。2.杆菌 伤寒沙门菌、大肠埃希菌、炭疽芽胞杆菌、枯草芽胞杆菌。3.弧菌 霍乱弧菌或水弧菌。（二）特殊结构观察1.荚膜 肺炎链球菌的荚膜，经革兰染色后，呈矛头状成双排列的球菌，菌体四周有不着色的透明圈。用黑斯（Hiss）荚膜染色后，菌体呈紫色，菌体四周有一淡紫色的荚膜圈。2.鞭毛 伤寒沙门菌的鞭毛，经鞭毛染色后，菌体和周身鞭毛均呈红色。3.芽胞 破伤风梭菌的芽胞，注意芽胞的大小、形状及其位置。经

9、革兰染色后，菌体呈紫色杆状，菌体顶端有一圆形不着色的芽胞。四、实验结果用红蓝铅笔绘出镜下所见细菌基本形态和特殊结构图，并作简单描述。五、思考题1.在光镜下能看到的细菌特殊结构有哪些？实验三 细菌不染色标本的检查一、实验目的1.掌握悬滴法标本的制作方法。2熟悉在光镜下观察细菌的动力。3.了解压滴法标本的制作方法。二、实验原理细菌不染色标本的检查可用于观察细菌的动力，在高倍镜下观察。三、实验材料1菌种 变形杆菌、葡萄球菌（812小时）肉汤培养物。2其它 凹玻片、盖玻片、载玻片、凡士林、镊子。四、实验方法（一）悬滴法图3-1 悬滴标本1取一张盖玻片，在其四角涂少许凡士林，以无菌操作取细菌12环置于盖

10、玻片中央2将凹玻片的凹孔向下，侧合于盖玻片上，避免空气进入，迅速翻转凹玻片，轻压盖玻片四角使粘合紧闭，防止水分蒸发。（见图3-1）3观察时，先以低倍镜找到视野，再换高倍镜，应下降集光器、缩小光圈减少亮光易于观察。变形杆菌有鞭毛，运动活泼，可向不同方向迅速运动；葡萄球菌无鞭毛，不能作真正运动，只能因水分子撞击作分子运动（布朗运动），应注意区别。（二）压滴法 1以接种环取菌液23环，放于载玻片中央。2用镊子挟住盖玻片，覆盖于菌液上。放置时，先使盖玻片一边接触菌液，缓缓放下，不发生气泡为佳。3先以低倍镜找到位置，再以高倍镜观察细菌运动。五、实验结果画图并描述变形杆菌的运动情况六、思考题1.细菌的真正

11、运动与分子运动有何区别？2.细菌的不染色标本检查法有哪些及其用途是什么？实验四 细菌涂片的制备与革兰染色一、实验目的1.掌握细菌涂片的制作及革兰染色法的步骤，结果观察。2.熟悉油镜的使用方法及注意事项。3.了解革兰染色法的原理。二、实验原理革兰染色法是细菌学中最常用的一种鉴别染色法，此染色法将细菌分为两大类：革兰阳性菌和革兰阴性菌，可以帮助鉴别细菌及治疗时选择适当的抗菌药物。1细胞壁结构学说 革兰阳性菌细胞壁结构较致密，肽聚糖层厚，脂质含量少，乙醇不易渗入；革兰阴性菌细胞壁结构疏松，肽聚糖层薄，含大量脂质，乙醇容易渗入。2等电点学说 革兰阳性菌等电点（pI23）比革兰阴性菌等电点（pI45）低

12、，在相同pH条件下，革兰阳性菌所带负电荷比革兰阴性菌多，故与带正电荷的结晶紫染料结合牢固，不易被95%乙醇脱色。3化学学说 革兰阳性菌菌体含有大量核糖核酸镁盐，可与碘、结晶紫牢固结合成大分之复合物，使已经着色的细菌不被95%乙醇脱色；革兰阴性菌菌体含核糖核酸镁盐很少，故容易被95%乙醇脱色。三、实验材料1菌种 金黄色葡萄球菌、大肠埃希菌。2革兰染液一套 结晶紫染液、碘液、95%乙醇、稀释石炭酸复红染液。3其它 载玻片、生理盐水、接种环、酒精灯、蜡笔、吸水纸等。四、实验方法（一）细菌涂片制备 1涂片 取一张洁净载玻片，用玻璃蜡笔在洁净载玻片上划分为二并标记，两边各滴1滴生理盐水，以无菌操作方法，

13、用接种环分别挑取少量葡萄球菌和大肠埃希菌于玻片两端的生理盐水中，并研磨成均匀混浊的菌液（如系液体标本，则不需加生理盐水，可直接涂于载玻片上），涂成1cm1cm大小的均匀薄膜，接种环灭菌后放回试管架上。取菌量不可太多，使盐水磨成灰白色为宜。2干燥 涂片最好在室温下自然干燥，如欲加速干燥，也可将涂膜背面置火焰上方不烤手的高处略加烘烤，但切勿紧靠火焰，以免将涂膜烤焦，细菌变形，染色后难以观察。3固定 涂片干燥后，手持玻片的一端，将载玻片的背面快速来回通过酒精灯火焰三次，共约23秒，注意温度不可太高，以玻片加温面触及皮肤感觉微烫而尚能忍受为度。固定的目的是杀死细菌，并使菌体与玻片粘附牢固，以免玻片上的

14、细菌在染色过程中被水冲洗掉，且固定后细菌蛋白质变形易被着色。固定完毕，放置待冷后再进行染色。（二）革兰染色法1初染 滴加结晶紫染液23滴，以全面覆盖涂膜为度，染色1分钟后用细流水冲洗，将玻片上积水轻轻甩干。2媒染 滴加卢戈（Lugol）碘液数滴，染色1分钟后用细流水冲洗，将玻片上积水轻轻甩干。3脱色 滴加95%乙醇数滴，轻轻前后摇动玻片数秒钟，使均匀脱色，然后倾斜玻片，使脱掉的染料随乙醇流去，再滴加乙醇，如此反复23次，直到流下的乙醇无色或稍呈淡紫色为止，大约30秒1分钟（灵活掌握时间），用细流水冲洗，将玻片上积水轻轻甩干。4复染 滴加稀释石炭酸复红液数滴，复染1分钟，用细流水冲洗，将玻片上积

15、水轻轻甩干。待标本片自然干燥或用吸水纸吸干后，在涂菌处滴加一滴香柏油，然后用显微镜油镜观察结果。【影响因素】（1）操作因素：涂片太厚或太薄，菌体分散不均匀，会影响乙醇脱色，造成染色结果不准确。固定时应避免菌体过分受热，否则会使菌体变性影响染色效果。脱色时应把握好时间，一般以流下的脱色剂不带颜色为准，若脱色时间过长易造成假阴性。（2）染液因素：所用染色液应防止水分蒸发而影响浓度，特别是碘液久存或受光作用后可形成碘酸，易失去媒染作用。脱色用的乙醇以95浓度为好，若瓶口密封不好或涂片上积水过多，均可引起乙醇浓度降低而增强脱色能力。（3）细菌因素：不同时间的细菌培养物，染色结果有差异。如葡萄球菌，培养

16、48小时以上的老龄菌，易染成红色，而幼龄菌则易染成紫色。细菌染色一般用1824小时的细菌培养物。五、实验结果葡萄球菌染成紫色，系革兰阳性菌（G+），呈葡萄状排列的球菌；大肠埃希菌染成红色，系革兰阴性菌（G），呈单个散在排列的杆菌。两种细菌选取典型视野画图并描述（染色性、形态、排列、特殊结构）。六、思考题1. 制备一张好的涂片注意些什么？ 2. 如革兰阳性菌染成革兰阴性菌可能有哪些原因？3细菌革兰染色的主要步骤有哪些？附录：1革兰染色液的配制（1）结晶紫染液：称取结晶紫48g，溶于95乙醇100ml中，配成结晶紫乙醇饱和液。取此饱和液20ml与1草酸铵水溶液80ml混匀，过滤后备用。（2）卢戈（

17、Lugol）碘液：先将碘化钾2g溶于10ml蒸馏水中，再加入碘1g，略加振摇，使之全部溶解后，再加蒸馏水至300ml既成。（3）95%乙醇或丙酮乙醇溶液（70ml95%乙醇加30ml丙酮混匀）。（4）稀释石炭酸复红染液： 1）称取碱性复红4g，溶解于95乙醇100ml中，配成碱性复红乙醇饱和液；2）取此饱和液10ml与50g/L石炭酸水溶液90ml混匀，配成石炭酸复红染液；3）取石炭酸复红染液10 ml加入蒸馏水90ml中混匀，即成稀释石炭酸复红染液。2鞭毛染色法（魏曦染色法） （1）染液：甲液：钾明矾饱和液2ml，50gL石炭酸液5ml，200gL鞣酸液2ml，混匀。乙液： 碱性复红乙醇饱和

18、液。用前，将甲液9份，乙液1份混合后过夜，次日过滤后使用，3天内使用效果最佳。此液不能长期保存。（2）染色方法：先将鞭毛菌在肉汤培养基中传代67次。取琼脂斜面培养基吸出凝渗水，加入2ml无菌蒸馏水，然后将肉汤中传代的细菌接种于斜面琼脂与液体交界处，再从该交界处向上划一直线，放人温箱中培养16小时。用接种环从交界处取一环菌液，轻轻放人盛有34ml蒸馏水的小碟液体表面，使细菌自由分散，浮在液体表面，静置于温箱内45分钟后，用接种环取一环液面混合液放于高度洁净的载玻片上，切勿研磨和摇动，置37或室温下让其自然干燥，切勿火焰固定，加数滴染液染色12分钟，轻轻水洗，干后用显微镜油镜检观察。（3）结果：细

19、菌菌体和鞭毛均染成红色。3荚膜染色法（黑斯染色法）（1）染液： 1）结晶紫染液：结晶紫饱和乙醇溶液5ml，加蒸馏水95ml，混合。2）200g/L硫酸铜水溶液。（2）染色方法：将荚膜菌涂片，在空气中自然干燥，无需加热固定，滴加结晶紫染液，在火焰上微微加热，使玻片上染液冒蒸气为止。再用硫酸铜水溶液冲洗，切勿用水冲洗。待干后油镜检查。（3）结果：细菌菌体染成紫色，荚膜染成淡紫色。4芽胞染色法(复红美蓝法)（1）染液：石炭酸复红液，95乙醇，碱性美蓝液(配法：取美蓝2g，溶于95乙醇 100ml中配成美蓝乙醇饱和液。取此饱和液30ml与00l氢氧化钾水溶液100ml均匀混合即成)。（2）染色方法：将

20、有芽胞的细菌培养物涂片，自然干燥后，火焰固定。滴加数滴石炭酸复红染液于涂片上，并用微火加温，使染液冒蒸气，持续5分钟，冷却后用流水轻轻冲洗；用95乙醇脱色2分钟，流水轻轻冲洗；再加数滴碱性美蓝染液复染0.5分钟，流水轻轻冲洗，干后油镜检查。（3）结果：细菌菌体染成蓝色，芽胞染成红色。 实验五 常用培养基制备一、实验目的1掌握各类培养基制备的基本程序及注意事项。2熟悉常用培养基的种类、成分及用途。二、实验材料 1试剂 牛肉膏、氯化钠、蛋白胨、琼脂粉、脱纤维绵羊血或兔血、蒸馏水、1N的NaOH、1N的HCl等。 2器材 三角烧瓶、量筒、精密pH试纸、天平、高压蒸气灭菌器、脱脂棉、滤纸、漏斗、无菌平

21、皿、酒精灯、电炉、血清凝固器等。三、实验方法（一）培养基制备的基本程序 制备一般培养基的基本程序可分为：调配、溶化、矫正pH、过滤、分装、灭菌、鉴定和保存等步骤。 1调配 按培养基组成准确称取各成分用量，放人三角烧瓶或大容量烧瓶中，加一定量蒸馏水，振摇后使其充分混匀。应注意染料、胆盐和指示剂等应在矫正pH后加入。 2溶化 将调配好的混合物在电炉上加热，随时搅拌，防止外溢，使其完全溶化。溶化完毕，注意补足失去的水分。 3矫正pH 可用pH比色法或精密pH试纸，矫正培养基的pH（pH矫正方法见本实验后附培养基pH测定）。一般将培养基的pH调至7.27.6左右。经高压灭菌后，其pH值约降低0.10.

22、2，故在矫正pH时应比实际需要的pH高 0.10.2。 4滤过 自配的培养基通常有一些混浊或沉淀，需滤过澄清后方可使用。液体或半固体培养基常用滤纸过滤，固体培养基在熔化后趁热以绒布或双层纱布加脱脂棉过滤。如称取的为半成品成分则不需要滤过。 5分装 根据需要将培养基分装于三角烧瓶或试管等。（1）基础培养基：一般分装于三角烧瓶内，灭菌后备用，以便随时分装倾注平板或配制营养培养基等；（2）琼脂斜面：通常在熔化后分装于试管，量约为试管高度的1413，加塞后灭菌，趁热摆成斜面，斜面长度约为试管长度的23，且保持试管下端有lcm柱高；（3）半固体培养基：分装量约为试管容量的1413，加塞灭菌后趁热直立，凝

23、固待用；（4）琼脂高层培养基：分装量约为试管长度的13，灭菌后趁热直立凝固待用；（5）液体培养基：分装量约为试管长度的13，灭菌后趁热直立待用；（6）琼脂平板：先将灭菌或加热熔化后的固体培养基，冷至50左右，以无菌操作倾注于灭菌平皿内。内径9cm的平皿约1315m1，若内径7cm的平皿约78m1，轻摇平皿，使培养基平铺于平皿底部，待凝固后将平皿翻转，置4保存备用。 6灭菌（1）高压蒸气灭菌：耐热物质配制成的培养基(如普通培养基等)常用高压蒸气灭菌，方法是加热15磅（10343kPacm2、121.3），1520分钟；含糖培养基加热10磅（6895kPacm2、115.6），1015分钟为宜，以

24、免破坏糖类物质。（2）间歇灭菌：不耐高热的物质配制成的培养基，如糖类、明胶和牛乳等常用间歇灭菌，方法是加热100 30分钟，置37温箱内过夜，第二天再加热100 30分钟，连续三次。（3）血清凝固器灭菌：富含蛋白质的培养基(如含血清或鸡蛋清的培养基)，需用血清凝固器进行间歇灭菌。方法是将配制好的培养基摆放在血清凝固器内(一般做成斜面)，第一天加热7530分钟，第二天加热80 30分钟，第三天加热8530分钟。在三次灭菌的间隙将培养基置37温箱内过夜。7鉴定 培养基鉴定的基本要求是：无菌试验：将灭菌后的培养基置37温箱中培养24小时，无任何细菌生长为合格；效果试验：将已知菌种接种至此培养基上，证

25、明相应的细菌可在此培养基上生长，且形态、菌落、生化反应等特征典型。8保存 制备好的培养基应注明名称、制作日期，用牛皮纸包裹或装于保鲜袋内，以减少水分蒸发，存放于4冰箱或冷暗处保存备用。琼脂平板应将底朝上，盖朝下放置；液体培养基应直立放置。（二）常用培养基的种类、制备及用途培养基按物理性状分为：液体培养基。固体培养基。半固体培养基。培养基按用途不同分为：基础培养基：含有细菌需要的基本营养成分，供营养要求不高的细菌生长繁殖需要，如肉膏汤培养基、普通琼脂平板及普通斜面培养基等；营养培养基：在普通培养基中加入血液、血清等营养物质即成营养培养基，供营养要求较高的细菌生长繁殖需要，如血琼脂培养基、血清肉汤

26、培养基等；选择培养基：在培养基中加入抑制非目的菌生长的化学物质或药物，利于目的菌的分离和检出，如SS琼脂平板、EMB琼脂平板等；鉴别培养基：供细菌生化反应试验用，可根据实验结果鉴别细菌。如糖发酵培养基、蛋白胨水培养基等；厌氧培养基：培养厌氧菌用，如疱肉培养基等。1液体培养基（1）肉膏汤培养基 成分： 牛肉膏 3g 蛋白胨 10g 氯化钠 5g蒸馏水 1000ml制法：1）用天平分别称取牛肉膏3g，蛋白胨10g，氯化钠5g置三角烧瓶中。2）加入蒸馏水1000ml，把三角烧瓶在电炉上加热，使蛋白胨等溶化。3）测定培养基的酸碱度，用1N的NaOH调pH至7.47.6，煮沸35分钟，必要时滤过。4）分

27、装试管或烧瓶，加塞，用牛皮纸包扎管口、瓶口。5）高压蒸气灭菌15磅20分钟取出冷却后，置4冰箱贮存备用。用途：肉膏汤培养基可供营养要求一般的细菌生长。（2）肉汤培养基成分： 新鲜牛肉 500g 蛋白胨 10g氯化钠 5g制法：1）将新鲜牛肉去除筋和脂肪，切碎绞细，加水1000ml，置4冰箱过夜。2）次日取出，搅拌均匀，加热10030分钟，用数层纱布或滤纸过滤，补足失去的水分。3）加入蛋白胨10g，氯化钠5g，加热溶化。4）冷至50左右，矫正pH至7.4。5）分装试管或烧瓶，加上塞，用牛皮纸包扎管口、瓶口。6）高压蒸气灭菌15磅20分钟取出冷却后，置4冰箱贮存备用。用途：作基础培养基使用，营养比

28、肉膏汤培养基好，可供营养要求一般的细菌生长。2普通琼脂培养基成分： 肉汤或肉膏汤 1000ml琼脂 2030g制法：（1）将琼脂加入肉汤或肉膏汤中，加热溶化。（2）矫正pH至7.4，分装于试管或三角烧瓶中，每管约5ml。（3）高压蒸气灭菌15磅20分钟。（4）取出试管，斜放使其凝成斜面培养基。 （5）将已溶化的肉汤或肉膏汤琼脂冷至50左右，以无菌操作注于无菌平皿中。内径9cm的平皿约1315m1，若内径7cm的平皿约78m1，厚度约34mm。凝固后即反转过来，底向上，以免在平皿盖上积存凝结水，即为普通琼脂培养基，亦称固体培养基，冷后置4冰箱保存备用。 用途：普通琼脂培养基用于一般细菌的分离培养

29、，纯种接种或保存菌种。3血液琼脂培养基成分： 普通琼脂培养基 100ml 无菌脱纤维绵羊血或兔血 810ml制法：（1）取已制备好的无菌普通琼脂100ml，加热溶解并冷至50左右。（2）在已消毒的无菌室内打开瓶口，瓶口通过火焰杀死瓶口外的杂菌，用无菌吸管吸取810ml血液（临用前置37水浴箱预温30分钟），加入100ml普通琼脂培养基内，轻轻摇匀。（3）在无菌条件下，倾注于无菌平皿中，冷凝后即成血琼脂平板培养基。凝固后即反转过来，底向上，置4冰箱保存备用。用途：血液琼脂培养基用于分离培养或保存营养要求高的细菌，如链球菌、肺炎链球菌。4巧克力色培养基成分：同血液琼脂培养基制法：（1）同血液琼脂培

30、养基，但在培养基中加入血液混匀后，须再置80水浴轻轻摇匀1015分钟，使血液由鲜红色转变为巧克力色。（2）冷至50左右，倾注于无菌平皿中，冷凝后即成巧克力色培养基。（3）凝固后即反转过来，底向上，置4冰箱保存备用。用途：巧克力色培养基主要用于分离培养奈瑟菌属、嗜血杆菌属等。5半固体培养基成分： 肉膏或肉膏汤 1000ml 琼脂 2.55g制法：（1）将2.55g琼脂加到1000ml肉膏汤中，加热熔化，矫正pH至7.4。（2）分装于小试管中，每管约23ml，加塞。（3）高压蒸气灭菌15磅20分钟。（4）冷却后4冰箱保存备用。用途：半固体培养基用于保存菌种或观察细菌的动力。6SS培养基成分：牛肉膏

31、 3g 蛋白胨 5g胆盐 8.510g 乳糖 10g琼脂 1.8g 枸橼酸钠 1014g硫代硫酸钠 8.510g 枸橼酸铁 0.5g0.5%中性红水溶液 4.5ml 0.1%煌绿溶液 0.33ml 蒸馏水 1000ml注：可购买半成品，直接称取，加热熔化，不需高压蒸气灭菌，即可倒平皿。制法：（1）将牛肉膏、琼脂、眎胨熔于蒸馏水中，加热熔化。（2）再加入胆盐、乳糖、硫代硫酸钠、枸橼酸钠、枸橼酸铁 ，稍加热，使其全部熔化。 （3）矫正pH至7.2，加入中性红、煌绿溶液摇匀，再煮沸一次。（4）待冷至50左右，倾注平皿，冷却后4冰箱保存备用。用途：用于粪便标本分离培养肠道致病菌，如沙门菌与志贺菌。四、

32、实验结果1液体培养基 观察颜色及透明度2半固体培养基 观察颜色及倒置后有无液体漏出3斜面 观察斜面是否平整4平板 观察颜色、厚薄，是否平整。若平板有细小凝固颗粒，可能是冲洗降温不均匀所致。五、思考题1何为培养基？试述常见培养基的种类和用途？2制备培养基的基本程序和注意事项？附录：培养基pH值的测定及矫正1.常用指示剂的配制 指示剂的种类繁多，可按需要选择所需的指示剂。在矫正培养基的PH时，一般多用酚红或溴麝香草酚蓝为指示剂。（1）0.2g/L酚红指示剂的配制：称取酚红0.lg，置于研钵中，一边研磨一边加入0.01mol/LNaOH溶液28.2ml，然后加蒸馏水使其总量为500ml即成，用于pH

33、的测定。（2）0.4g/L溴麝香草酚蓝指示剂的配制：称取溴麝香草酚蓝0.4g，在研钵中随研随加0.1mol/LNaOH溶液6.4m1，然后加蒸馏水至100ml，即为4g/L溴麝香草酚蓝贮存液。贮存液加蒸馏水作10倍稀释即为0.4g/L溴麝香草酚蓝指示剂，用于矫正pH值。2.标准比色管的配制 用不同量的缓冲液混合，配制各种pH，再加入一定量的指示剂如酚红等即成。配制方法如下：（1）磷酸缓冲液的配制： 1)115molLKH2P04溶液：称取KH2PO4 (AR)9.078g，加蒸馏水至1000ml，使之溶解即成。 2)115molLNa2HP04溶液：称取无水Na2HP049.470g，加蒸馏水

34、至1000ml，使之溶解即成。（2）标准比色管的配制(表5-1)： 表5-1 不同pH的比色管配方 pH 115molLKH2P04(m1) 115molLNa2HP04(ml) 0.2gL酚红液(m1)6.4 7.30 2.70 0.5 6.6 6.30 3.70 0.5 6.8 5.10 4.90 0.5 7.0 3.70 6.30 0.57.2 2.70 7.30 0.57.4 1.90 8.10 0.57.6 1.32 8.86 0.57.8 0.88 9.12 0.58.0 0.56 9.44 0.58.2 0.32 9.68 0.58.4 0.20 9.80 0.5按不同pH的比色

35、管配方加样，每管10ml，加塞后混匀，并用石蜡封口（或熔封管口），存放暗处备用。3.矫正培养基pH 取与标准管同口径的试管(通常用华氏试管)3支，于第1、3管各加入欲矫正pH的培养基5ml，并在第一管中加入0.2gL酚红液0.25ml作为测定管，混匀。第2管中加入蒸馏水5ml，第4管为标准pH比色管。4个试管分别按图5-1插入比色架中进行比色。若测定管中培养基过酸或过碱(多为偏酸)，可用0.1molLNaOH或0.1molLHCl矫正，直到测定管颜色与标准比色管颜色相同为止。加酸或加碱时要缓慢、准确，每加一滴后要充分混匀，比色后再加一滴，准确记录加入的量。计算：设5ml培养基矫正pH7.4需0

36、.1molL NaOH 0.15ml，现制培养基1000ml，需加NaOH量为：图5-1 比色架1.培养基管 2.标准比色管3.测定管 4.蒸馏水管5:1000=0.15:XX=（0.151000）/5=30ml 若将0.1molLNaOH换算成lmolLNaOH，则需3ml。培养基中加入所需NaOH后，充分混匀后，再测一次pH，如仍未达到所需求的pH值，再按上法加以矫正。 实验六 细菌的接种技术及培养方法一、实验目的1.熟悉接种用具及无菌操作要领，细菌的培养方法。2.掌握平板、斜面、液体和半固体等培养基接种方法。二、实验材料1菌种 葡萄球菌、大肠埃希菌、痢疾志贺菌、枯草芽胞杆菌、链球菌。2培

37、养基 液体(肉汤)、半固体、固体(琼脂平板和斜面)培养基。3其他 接种环、接种针、酒精灯等。三、实验方法【接种工具】接种环和接种针，由三部分组成，环（针）、金属柄和绝缘柄。接种环用于液体、固体培养基的细菌接种，接种针用于半固体培养基的穿刺接种。【接种方法】（一）平板划线接种法主要用于临床标本中混杂着多种细菌的分离培养，经过划线接种，将细菌分散到固体培养基的表面，以获得单个菌落。常用的平板划线接种法可分为以下两种：1.分区划线法 此法多用于含菌量较多的粪便、脓汁、痰液等标本的细菌分离培养。具体操作如下：（1）右手以持毛笔式握住接种环，垂直在火焰上烧灼灭菌。（2）接种环冷却后，以无菌操作沾取葡萄球

38、菌和大肠埃希菌混合液1环。（3）左手持平板培养基，左手拇指、食指开启平皿盖，右手将取菌后的接种环在平板培养基表面一角来回划线涂布，密而不重叠，接种环与培养基表面呈3045角度，作为第一区，约占平板总表面积的1/5。划线时，以腕力在平板表面作轻快的滑动动作，不可用力太大，以免划破培养基表面。 图6-1 分区划线法（4）再次灭菌接种环，以杀灭接种环上剩余的细菌，待冷。将平皿转动一定角度进行第2区划线，第2区划线与第1区划线开始相交23条，以后可不必相交。约占平板表面积的1/4。再灭菌接种环后用相同方法进行第3区、第4区划线。（5）接种完毕，灭菌接种环。平板底部做好标记（姓名、班级、日期、标本名称等

39、），倒置（平板底部向上）于37温箱中培养1824小时，观察结果（见图6-1）。琼脂平板表面生长出单个菌落和菌苔，注意两种菌落的大小、形状、边缘、表面结构、颜色、透明度等性状有无区别。 注意事项：严格无菌操作：操作时不能说话，不能离酒精灯太远，平皿盖不能开得太大，以免空气污染；划线时，力量要适中，切勿划破培养基表面；充分利用平板表面，但第四区不能与第一区划线相交。2.连续划线法 此法多用于含菌量不多的标本或咽拭、棉拭的细菌分离培养。具体操作如下：（1）将接种环在火焰上烧灼灭菌。（2）待接种环冷却后，以无菌操作取标本或少许菌液。（3）涂布于培养基的1/5处，然后在培养基表面连续左右划曲线，密而不重

40、叠，并逐渐下移，将整个平板布满曲线。（4）接种完毕，灭菌接种环。平板底部做好标记（姓名、日期、标本名称等），倒置（平板底部向上）于37温箱中培养1824小时，观察结果（见图6-2）。图6-2 连续划线法 （二）斜面培养基接种法主要用于纯培养、保存菌种及生化反应试验等。通常是从平板培养物上调取某一单个菌落，移种至斜面培养基上。图6-3 斜面培养基接种法1.左手持平板培养基（或菌种管和接种管），右手持接种环或接种针在火焰上烧灼灭菌，待冷后挑取单个菌落。2.左手换取待接种的斜面培养基，斜面部向上，以右手手掌与小指拔取并夹持试管塞，管口通过火焰灭菌。3.将取菌后的接种环（针）伸入斜 面管内，先从斜面底部到顶部划一条直线，然后再从