生物分离工程-第七章-色谱技术.ppt

1、生物工程下游技术生物工程下游技术第七章第七章 色谱技术色谱技术目的和要求目的和要求 了解色谱原理，掌握各种常用色了解色谱原理，掌握各种常用色谱方法的操作与应用谱方法的操作与应用 。目录目录n色谱原理与分类色谱原理与分类n色谱色谱过程理论模型过程理论模型n分离度分离度n凝胶过滤凝胶过滤色谱色谱n离子交换离子交换色谱色谱n疏水性相互作用疏水性相互作用色谱色谱n流通流通色谱色谱本章主要知识点本章主要知识点n n什么是色谱分离技术？什么是色谱分离技术？n n色谱分离技术的分类色谱分离技术的分类n n什么是色谱柱的理论塔板数以及如何计算？什么是色谱柱的理论塔板数以及如何计算？n n吸附色谱及其分类和基本

2、原理吸附色谱及其分类和基本原理n n什么是分配色谱？什么是分配色谱？n n离子交换色谱的分类及应用离子交换色谱的分类及应用n n凝胶色谱的分离原理及分类凝胶色谱的分离原理及分类n n离子交换及疏水作用层析的原理离子交换及疏水作用层析的原理n n高效液相色谱的分离原理及应用高效液相色谱的分离原理及应用n n蛋白质分离的常用色谱方法有哪些？蛋白质分离的常用色谱方法有哪些？色谱技术（分配色谱）n n概念：色谱技术是一组相关分离方法的总称，色概念：色谱技术是一组相关分离方法的总称，色谱柱的一般结构含有谱柱的一般结构含有固定相固定相（多孔介质）和（多孔介质）和流动流动相相，根据物质在两相间的，根据物质在

3、两相间的分配行为不同分配行为不同（由于亲（由于亲和力差异），和力差异），经过多次分配经过多次分配（吸附（吸附-解吸解吸-吸附吸附-解解吸吸），达到分离的目的。），达到分离的目的。一、色谱原理与分类一、色谱原理与分类学习要点学习要点n识记：识记：色谱色谱方法分类方法分类 n理解：理解：色谱色谱原理原理 1、定义（、定义（chromatograph）n定义定义 色谱色谱是根据混合物中溶质在互不混溶的两相间是根据混合物中溶质在互不混溶的两相间分配分配行为的差别行为的差别而引起移动速度的不同而进行分离的方而引起移动速度的不同而进行分离的方法。法。2、原理、原理 色谱色谱操作中互不混溶的两操作中互不混溶

4、的两相分别称为固定相和流动相分别称为固定相和流动相。相。固定相固定相填充于柱内形填充于柱内形成固定床，在柱的入口端成固定床，在柱的入口端加入料液后，连续输入加入料液后，连续输入流流动相动相，料液中溶质在流动，料液中溶质在流动相与固定相之间扩散传质，相与固定相之间扩散传质，产生分配平衡产生分配平衡 在在色谱色谱过程中，分配过程中，分配系数大的溶质在固定系数大的溶质在固定相上存在的相上存在的概率大概率大，随流动相随流动相移动速度小移动速度小。由此，溶质之间由于由此，溶质之间由于移动速度的不同而得移动速度的不同而得到分离。到分离。3、色谱分离方法的分类 色谱分离方法很多，种类有四、五十种，但常用于生

5、物大分子分离的色谱方法，按机理分以下几种：n n吸附色谱n n分配色谱n n离子交换色谱n n凝胶色谱色谱系统的基本组成（1）流动相分类）流动相分类n气相气相色谱色谱n液相液相色谱色谱n超临界超临界色谱色谱（2）固相分类）固相分类n类型类型 分配分配色谱色谱（固定相为液相）（固定相为液相）吸附吸附色谱色谱（固定相为固相）（固定相为固相）n形状形状 纸纸色谱色谱 薄层薄层色谱色谱 柱柱色谱色谱纸层析薄层层析（3）操作压力分类）操作压力分类n低压液相低压液相色谱色谱（4.0 MPa）（4）流动相流动方式分类）流动相流动方式分类n轴向流轴向流色谱色谱n径向流径向流色谱色谱（5）分离操作方式分类）分离

6、操作方式分类n洗脱洗脱色谱色谱n迎头迎头色谱色谱n顶替展开顶替展开（6）机理分类）机理分类n凝胶过滤凝胶过滤色谱色谱n离子交换离子交换色谱色谱n反相反相色谱色谱n疏水性相互作用疏水性相互作用色谱色谱n亲和亲和色谱色谱4、色谱分离原理n n分配系数分配系数n n可由可由LangmuirLangmuir方程得出方程得出n nK Kd d-分配系数分配系数n nq q、c-c-溶质在固相和液相中的浓度溶质在固相和液相中的浓度uu保留时间（保留时间（t tR R）和保留体积（）和保留体积（V VR R）uu反应样品在柱子中的保留或阻滞能力，是色谱过程的反应样品在柱子中的保留或阻滞能力，是色谱过程的基本

7、热力学参数之一基本热力学参数之一n n阻滞因子阻滞因子RtRtn n阻滞因子是在色谱系统中溶质的移动速度和标准物（与阻滞因子是在色谱系统中溶质的移动速度和标准物（与固定相没有亲和力的流动相固定相没有亲和力的流动相 Kd=0Kd=0）的迁移率之比）的迁移率之比n n其意义在于体现某一种溶质与固定相之间的亲和力大小其意义在于体现某一种溶质与固定相之间的亲和力大小n n洗脱体积洗脱体积n n色谱柱中，使溶质从柱中流出所需流动相体积，色谱柱中，使溶质从柱中流出所需流动相体积，为洗脱体积为洗脱体积n n不同的溶质，由于和固定相的亲和力的不同，洗不同的溶质，由于和固定相的亲和力的不同，洗脱体积也有所差异脱

8、体积也有所差异塔板理论n马丁（Martin）和欣革（Synge）最早提出塔板理论，将色谱柱比作蒸馏塔，把一根连续的色谱柱设想成由许多小段组成。在每一小段内，一部分空间为固定相占据，另一部分空间充满流动相。组分随流动相进入色谱柱后，就在两相间进行分配。并假定在每一小段内组分可以很快地在两相中达到分配平衡，这样一个小段称作一个理论塔板（theoretical plate），一个理论塔板的长度称为理论塔板高度（theoretical plate height）H。n经过多次分配平衡，分配系数小的组分，先离开蒸馏塔，分配系数大的组分后离开蒸馏塔。由于色谱柱内的塔板数相当多，因此即使组分分配系数只有微小

9、差异，仍然可以获得好的分离效果。n n色谱柱的理论塔板数、塔板高度色谱柱的理论塔板数、塔板高度n n反应不同时刻溶质在色谱柱中的分布以及分离度与反应不同时刻溶质在色谱柱中的分布以及分离度与柱高之间的关系柱高之间的关系n n理论塔板数的计算方法：理论塔板数的计算方法：n nN-N-理论塔板数理论塔板数 tR-tR-保留时间保留时间n nWW1/21/2-半峰宽半峰宽 Wb-Wb-峰底宽度峰底宽度n n理论塔板高度：理论塔板高度：L-L-柱长柱长5、分离度、分离度n识记：识记：分离度的概念分离度的概念 n理解：理解：如何分离度判断两个相邻洗脱峰如何分离度判断两个相邻洗脱峰的分离程度的分离程度 （1

10、）定义及表述）定义及表述n定义定义 分离度又称分辨率，是表达两种洗脱曲线相分离度又称分辨率，是表达两种洗脱曲线相邻的溶质相互分离的程度邻的溶质相互分离的程度 n分离度的表达分离度的表达nGaussGauss洗脱曲线的分离度洗脱曲线的分离度（2）分离度的其它表征方法）分离度的其它表征方法n容量因子容量因子 容量因子是固定相与流动相间溶质分配量之比，用容量因子是固定相与流动相间溶质分配量之比，用k k表示表示n选择性选择性 选择性为洗脱峰相邻的两种溶质的容量因子之比选择性为洗脱峰相邻的两种溶质的容量因子之比6、凝胶过滤、凝胶过滤色谱色谱学习要点学习要点n理解：理解：凝胶过滤的原理和操作，凝胶过凝胶

11、过滤的原理和操作，凝胶过滤介质的要求和影响分离特性的因素滤介质的要求和影响分离特性的因素 n应用：应用：掌握凝胶掌握凝胶色谱色谱的应用及特点的应用及特点 （1）定义）定义 凝胶过滤凝胶过滤色谱色谱利用凝胶粒子为固定利用凝胶粒子为固定相，是根据料液中溶质相对分子量的差相，是根据料液中溶质相对分子量的差别进行分离的液相别进行分离的液相色谱色谱法法 （2）原理）原理n在在GFCGFC柱中，分子量大的溶质柱中，分子量大的溶质不能进入凝胶介质，而沿介质不能进入凝胶介质，而沿介质空隙流过空隙流过n分子量很小的溶质能够进入所分子量很小的溶质能够进入所有的细孔中，其洗脱体积接近有的细孔中，其洗脱体积接近柱体积

12、柱体积n分子两介于两者之间的溶质能分子两介于两者之间的溶质能够进入部分细孔中够进入部分细孔中（3）分配系数）分配系数n凝胶过滤凝胶过滤色谱色谱的分配系数的分配系数可用下式表示可用下式表示nGFC的分配系数在的分配系数在01之间，分离精度有限。之间，分离精度有限。Smallest solute:(acetone)Full access to the pores,Vt;Largest solute:(Blue Dx 2000)Excluded from the pores,V0（4）影响分配系数因素）影响分配系数因素n相对分子量相对分子量 相对分子量一定的溶质的相对分子量一定的溶质的m值为常数，为

13、凝胶介质对该值为常数，为凝胶介质对该溶质的有效孔隙率溶质的有效孔隙率p；分配系数随相对分子量的分配系数随相对分子量的 增加而降低；增加而降低；n分子形状分子形状n凝胶结构凝胶结构（5）介质应满足条件）介质应满足条件n亲水性高，表面惰性亲水性高，表面惰性n稳定性好，在较宽的稳定性好，在较宽的pH和离子强度范围及化和离子强度范围及化学试剂中保持稳定，使用寿命长；学试剂中保持稳定，使用寿命长；n具有一定的孔径分布范围；具有一定的孔径分布范围；n机械强度高，允许较高的操作压力；机械强度高，允许较高的操作压力；（6）常用的）常用的GFC介质介质n葡聚糖凝胶介质葡聚糖凝胶介质 葡聚糖（右旋糖酐）与环氧氯丙

14、烷合成葡聚糖（右旋糖酐）与环氧氯丙烷合成n琼脂糖凝胶介质琼脂糖凝胶介质 琼脂糖与环氧氯丙烷合成琼脂糖与环氧氯丙烷合成n其他亲水性高分子合成的凝胶介质其他亲水性高分子合成的凝胶介质n多种多糖制备的凝胶介质多种多糖制备的凝胶介质Sephadex GSepharose CL/FFTSKSuperose（7）凝胶特性参数）凝胶特性参数n排阻极限排阻极限 不能扩散到凝胶网络内部的最小分子的相对分子质量不能扩散到凝胶网络内部的最小分子的相对分子质量n分级范围分级范围 能为凝胶阻滞并且相互之间可以得到分离的溶质的相对分子能为凝胶阻滞并且相互之间可以得到分离的溶质的相对分子量范围量范围n溶胀率溶胀率 介质溶胀

15、后每千克干凝胶所吸收的水分的百分数介质溶胀后每千克干凝胶所吸收的水分的百分数其他参数其他参数 凝胶粒径、床体积、空隙体积凝胶粒径、床体积、空隙体积（8）影响操作的因素）影响操作的因素n线速度线速度n料液体积料液体积n料液浓度料液浓度n分子量与分配系数关系分子量与分配系数关系n凝胶粒径凝胶粒径（9）应用）应用n分离纯化分离纯化n脱盐脱盐n相对分子量测定相对分子量测定（10）特点）特点n溶质与介质溶质与介质不发生任何形式的相互作用不发生任何形式的相互作用，因此可采，因此可采用恒定洗脱法洗脱展开，操作条件温和，产品收率用恒定洗脱法洗脱展开，操作条件温和，产品收率接近接近100%；n分离结束后分离结束

16、后无需苛刻的介质清洗或再生无需苛刻的介质清洗或再生，循环操作，循环操作易实现，提高了产品纯度；易实现，提高了产品纯度；n作为脱盐手段，作为脱盐手段，GFC比透析法速度快、精度高；与比透析法速度快、精度高；与超滤法相比，剪切应力小，蛋白活性收率高；超滤法相比，剪切应力小，蛋白活性收率高；n分离机理简单，操作参数小，规模放大容易；分离机理简单，操作参数小，规模放大容易；（11）不足）不足n仅根据溶质间相对分子质量的差异进行分离，仅根据溶质间相对分子质量的差异进行分离，选择性低，料液处理量小选择性低，料液处理量小，一般为柱体积的，一般为柱体积的5%；n经经GFC洗脱展开后产品洗脱展开后产品被稀释被稀

17、释，因此需要在，因此需要在其它浓缩作用的单元操作后使用；其它浓缩作用的单元操作后使用；7、离子交换、离子交换色谱色谱学习要点学习要点n理解：理解：离子交换离子交换色谱色谱的原理和操作，线的原理和操作，线性剃度洗脱过程和逐次洗脱过程性剃度洗脱过程和逐次洗脱过程 n应用：应用：掌握离子交换掌握离子交换色谱色谱的应用特点的应用特点 （1）概念）概念 离子交换离子交换色谱色谱利用利用离子交换剂为固定离子交换剂为固定相，是根据相，是根据荷电溶荷电溶质与离子交换剂之质与离子交换剂之间的静电相互作用间的静电相互作用力力的差别进行溶质的差别进行溶质分离的洗脱分离的洗脱色谱色谱法法（2）分配系数）分配系数n溶质

18、在离子交换剂上的分配系数可表示为溶质在离子交换剂上的分配系数可表示为其中其中m为离子强度无限大时溶质的分配系数为离子强度无限大时溶质的分配系数n分配系数对分配系数对I 很敏感，很敏感，I 微小的变化都会引起微小的变化都会引起分配系数的改变；分配系数的改变；n不同蛋白质不同蛋白质B值相差很大值相差很大主要阴离子交换配基主要阴离子交换配基二乙胺乙基，二乙胺乙基，Diethylaminoethyl(DEAE)Quaternary aminoethyl(QAE)季胺乙基，季胺乙基，Quaternary ammonium(Q)主要阳离子交换配基主要阳离子交换配基羧甲基，羧甲基，Carboxymethyl

19、(CM)磺丙基，磺丙基，Sulphopropyl(SP)Methyl sulphonate(S)（3）线性洗脱法）线性洗脱法n线形洗脱法（线形洗脱法（linear gradient elution)流动相的离子强度流动相的离子强度线性线性增大，因此溶质的分配系数连续降低，增大，因此溶质的分配系数连续降低，移动速度逐渐增大移动速度逐渐增大n特点特点 难于洗脱的溶质在较小流动相体积下洗脱；难于洗脱的溶质在较小流动相体积下洗脱；改变流动相离子强度增大速度可调节溶质的洗脱体积；改变流动相离子强度增大速度可调节溶质的洗脱体积；流动相离子强度（盐浓度）连续增大，不出现干扰峰，操作流动相离子强度（盐浓度）连

20、续增大，不出现干扰峰，操作范围广；范围广；需要特殊调配浓度梯度的设备需要特殊调配浓度梯度的设备（4）阶跃梯度洗脱法）阶跃梯度洗脱法n阶跃梯度洗脱法（阶跃梯度洗脱法（Stepwise elution）流动相的离子强度流动相的离子强度阶跃增大阶跃增大，溶质的分配系数的降低和移动，溶质的分配系数的降低和移动速度的增大也是速度的增大也是阶段式阶段式的。的。n特点特点 当阶跃速度很快，则其接近线性梯度洗脱；反之，则接近恒当阶跃速度很快，则其接近线性梯度洗脱；反之，则接近恒定洗脱；定洗脱；利用切换不同盐浓度的流动相进行洗脱，不需要特殊梯度设利用切换不同盐浓度的流动相进行洗脱，不需要特殊梯度设备，操作简便；

21、备，操作简便；流动相浓度不连续变化，易出干扰峰；流动相浓度不连续变化，易出干扰峰；易出现多组分洗脱峰重叠现象；易出现多组分洗脱峰重叠现象；（5）洗脱时间）洗脱时间线性梯度洗脱过程中溶质的迁移速度线性梯度洗脱过程中溶质的迁移速度vp为为m(I)不再为常数，不再为常数，而是而是I的函数的函数 由于与生物大分子相比，由于与生物大分子相比，IEC柱内盐离子在固定相粒子内柱内盐离子在固定相粒子内传质非常快，盐离子在两相间的平衡瞬间完成，则传质非常快，盐离子在两相间的平衡瞬间完成，则对盐离子而言，可有如下的方程：对盐离子而言，可有如下的方程：对线性梯度而言对线性梯度而言洗脱时间洗脱时间 通过测定不同流动相

22、离子强度梯度下溶质洗脱位置通过测定不同流动相离子强度梯度下溶质洗脱位置离子强度离子强度Ip值，可获得值，可获得Ip与与GH之间的关系曲线之间的关系曲线其中其中洗脱时间为：洗脱时间为：（P275 图图7-21）（6）IEC柱内溶质迁移柱内溶质迁移n在线性梯度洗脱条件下，在线性梯度洗脱条件下，IEC柱内溶质区带的后部柱内溶质区带的后部移动速度高于前部，即线性梯度洗脱具有移动速度高于前部，即线性梯度洗脱具有区带浓缩区带浓缩作用；作用；n由于轴向返混和传质阻力的影响，溶质区带在洗脱由于轴向返混和传质阻力的影响，溶质区带在洗脱过程中过程中不断分散不断分散；n洗脱操作前期，返混等占主导地位，区带宽度不断洗

23、脱操作前期，返混等占主导地位，区带宽度不断增加；增加；n随着区带宽度的增加，区带前后溶质运动速度差增随着区带宽度的增加，区带前后溶质运动速度差增大，即浓缩作用增大大，即浓缩作用增大n当区带宽度增至一定值后，浓缩与分散作用达到平当区带宽度增至一定值后，浓缩与分散作用达到平衡，区带将以一定的宽度向下移动衡，区带将以一定的宽度向下移动（7）分离度分离度n当离子强度梯度一定时，分离度与柱高无关当离子强度梯度一定时，分离度与柱高无关n当柱高一定时，分离度随离子强度梯度的降低而增大当柱高一定时，分离度随离子强度梯度的降低而增大n分离度与分离度与 成反比成反比（8）特点）特点n料液处理量大，具有浓缩作用；料

24、液处理量大，具有浓缩作用；n应用范围广泛，通过优化条件可大幅度提高分离的应用范围广泛，通过优化条件可大幅度提高分离的选择性，所需柱长短；选择性，所需柱长短；n吸附作用机理明确，非特异性吸附小，产品回收率吸附作用机理明确，非特异性吸附小，产品回收率高；高；n离子交换剂种类多，选择余地大，价格远低于亲和离子交换剂种类多，选择余地大，价格远低于亲和吸附剂；吸附剂；n影响分离特性因素复杂；影响分离特性因素复杂；8、疏水性相互作用、疏水性相互作用色谱色谱n学习要点学习要点n理解：原理，影响疏水性吸附的因素理解：原理，影响疏水性吸附的因素 n应用：掌握疏水性相互作用应用：掌握疏水性相互作用色谱色谱方法对方

25、法对蛋白质分离蛋白质分离 （1）定义）定义 疏水性相互作用疏水性相互作用色谱色谱利用表面偶联弱疏水性利用表面偶联弱疏水性基团（疏水性配基）的疏水性吸附剂为固定相基团（疏水性配基）的疏水性吸附剂为固定相，根据蛋白质与疏水性吸附剂之间的，根据蛋白质与疏水性吸附剂之间的弱疏水性弱疏水性相互作用相互作用的差别进行蛋白质类生物大分子分离的差别进行蛋白质类生物大分子分离纯化的洗脱纯化的洗脱色谱色谱法。法。（2）原理）原理n组成蛋白质的氨基酸中包括一些组成蛋白质的氨基酸中包括一些疏水性氨基酸疏水性氨基酸基团，如苯丙基团，如苯丙氨酸，酪氨酸；氨酸，酪氨酸；n这些基团大部分处于蛋白质内部，但有这些基团大部分处于

26、蛋白质内部，但有部分疏水基团暴露于部分疏水基团暴露于蛋白质表面蛋白质表面；n在在高离子强度高离子强度盐溶液中，蛋白质表面的盐溶液中，蛋白质表面的水化层被破坏水化层被破坏，更多更多的疏水部分暴露在外的疏水部分暴露在外n这些暴露在外的这些暴露在外的疏水基团疏水基团与介质上的与介质上的弱疏水性配基弱疏水性配基发生疏水发生疏水性作用，被固定相吸附性作用，被固定相吸附n蛋白质在疏水性吸附剂上的蛋白质在疏水性吸附剂上的分配系数分配系数随流动相盐析随流动相盐析盐浓度盐浓度的的提高而增大提高而增大nHIC采用采用高盐下吸附高盐下吸附，低盐下洗脱低盐下洗脱原理图示原理图示（3）疏水性吸附剂）疏水性吸附剂n常用配

27、基常用配基 苯基、短链烷基、苯基、短链烷基、烷氨基、聚乙二醇聚醚烷氨基、聚乙二醇聚醚n修饰密度修饰密度 疏水配基修饰密度一般在疏水配基修饰密度一般在1040 umol/ml 疏水性吸附作用与配基的疏水性和配基目的成疏水性吸附作用与配基的疏水性和配基目的成正比，故配基的修饰密度应根据配基的疏水性正比，故配基的修饰密度应根据配基的疏水性而异而异。（4）影响疏水性吸附的因素）影响疏水性吸附的因素离子强度、种类和破坏水化作用的物质离子强度、种类和破坏水化作用的物质n离子强度及种类离子强度及种类 蛋白质的疏水性吸附作用随离子强度提高而增大；蛋白质的疏水性吸附作用随离子强度提高而增大；离子的种类也对蛋白质

28、疏水性吸附有着重要影响离子的种类也对蛋白质疏水性吸附有着重要影响n破坏水化作用的物质破坏水化作用的物质 离子半径大、电荷密度低的阴离子可减弱水分子间相互作用，离子半径大、电荷密度低的阴离子可减弱水分子间相互作用，具有破坏水化作用的性质（离液离子）具有破坏水化作用的性质（离液离子）离液离子存在下疏水性作用减弱；离液离子存在下疏水性作用减弱；乙二醇和丙三醇等含羟基的物质也具有影响水化的作用，降乙二醇和丙三醇等含羟基的物质也具有影响水化的作用，降低蛋白疏水性吸附作用，作为洗脱促进剂；低蛋白疏水性吸附作用，作为洗脱促进剂；影响疏水性吸附的因素影响疏水性吸附的因素离液离子及顺序离液离子及顺序影响疏水性吸

29、附的因素影响疏水性吸附的因素表面活性剂及温度表面活性剂及温度n表面活性剂表面活性剂 表面活性剂可与吸附剂及蛋白质的疏水部位结合，表面活性剂可与吸附剂及蛋白质的疏水部位结合，从而减弱蛋白质的疏水性吸附从而减弱蛋白质的疏水性吸附。n温度温度 一般吸附为放热过程，而一般吸附为放热过程，而疏水性吸附的结合作用随疏水性吸附的结合作用随温度升高而增大温度升高而增大（5）特点）特点n在高盐浓度下疏水作用较大，在高盐浓度下疏水作用较大，HIC可直接分可直接分离盐析后蛋白质溶液离盐析后蛋白质溶液n可通过调节疏水性配基链长和密度调节可通过调节疏水性配基链长和密度调节HIC的吸附力的吸附力n吸附剂种类多，选择余地大

30、吸附剂种类多，选择余地大9 9、反相、反相色谱色谱学习要点学习要点n理解理解：反相色谱技术的原理及操作，：反相色谱技术的原理及操作，n应用应用：了解反相色谱技术的应用范围及：了解反相色谱技术的应用范围及优缺点优缺点 （1 1）定义）定义n定义定义 利用表面利用表面非极性非极性的反相介质为固定相，极性有机溶剂的的反相介质为固定相，极性有机溶剂的水溶液为流动相，是根据溶质极性（疏水性）的差别进水溶液为流动相，是根据溶质极性（疏水性）的差别进行分离纯化的洗脱层析法行分离纯化的洗脱层析法n与与HIC的异同的异同 反相层析中溶质亦通过疏水性作用分配于固定相表面；反相层析中溶质亦通过疏水性作用分配于固定相

31、表面；反相层析固定相表面完全被非极性基团所覆盖，表现强反相层析固定相表面完全被非极性基团所覆盖，表现强烈的疏水性；烈的疏水性；必须采用极性有机溶剂或其水溶液进行洗脱必须采用极性有机溶剂或其水溶液进行洗脱（2 2）分配系数）分配系数n溶质在反相溶质在反相色谱色谱中分配系数取决于溶质的疏中分配系数取决于溶质的疏水性，疏水性越大，分配系数越大；水性，疏水性越大，分配系数越大；n当固定相一定时，可通过调节流动相的组成当固定相一定时，可通过调节流动相的组成调整溶质的分配系数；调整溶质的分配系数；n流动相的极性越大，溶质的分配系数越大，流动相的极性越大，溶质的分配系数越大，因此反相层析多采用降低流动相极性

32、的线性因此反相层析多采用降低流动相极性的线性梯度洗脱法梯度洗脱法（3 3）常用介质）常用介质n载体载体 硅胶、高分子聚合物微球硅胶、高分子聚合物微球n配基配基 丁烷基丁烷基(C4)、辛烷基、辛烷基(C8)、十八烷基、十八烷基(C18)或苯基或苯基n修饰方法修饰方法（4 4）特点）特点n反相介质性能稳定，分离效率高；反相介质性能稳定，分离效率高；n应用广泛，可用于分离蛋白质、肽、氨基酸、应用广泛，可用于分离蛋白质、肽、氨基酸、多糖、植物碱等，应用于科学研究、临床诊多糖、植物碱等，应用于科学研究、临床诊断、工业检测和环境保护等各个行业；断、工业检测和环境保护等各个行业；n作为产品纯化制备手段，多限

33、于实验室规模作为产品纯化制备手段，多限于实验室规模的应用。的应用。10、流通、流通色谱色谱学习要点学习要点n理解：理解：流通流通色谱色谱技术的原理及操作技术的原理及操作 n应用：应用：了解了解流通色谱流通色谱技术的应用范围及技术的应用范围及优缺点优缺点 （1）定义定义n定义定义 流通流通色谱色谱指利用含有对流孔的介质为固定相指利用含有对流孔的介质为固定相的液相的液相色谱色谱法法流通色谱作为一种分离模式，可包括各种吸附色谱，如IEC、HIC、AC和RPC传统传统色谱色谱的缺陷的缺陷n传统的吸附传统的吸附色谱色谱介质孔径较小，一般在介质孔径较小，一般在100nm以下，流体阻力大；以下，流体阻力大；

34、n通常的通常的色谱色谱操作压力下流体无法进入固定相操作压力下流体无法进入固定相介质的孔内，孔内传质为扩散传质；介质的孔内，孔内传质为扩散传质；n柱效随流速增大而迅速下降，动态吸附容量柱效随流速增大而迅速下降，动态吸附容量亦如此；亦如此；（2）介质结构介质结构n穿透孔穿透孔 孔径在孔径在0.60.8 um,孔内孔内流动为流动为对流对流形式；形式；n扩散孔扩散孔 孔径在孔径在50100 nm,孔内孔内传质为传质为扩散传质扩散传质；（3）介质结构的特点介质结构的特点n流通色谱流通色谱介质穿透孔之间以扩散孔相连，保介质穿透孔之间以扩散孔相连，保证了介质大的比表面积和溶质吸附量证了介质大的比表面积和溶质

35、吸附量n扩散孔长度大大缩短，降低了扩散传质阻力；扩散孔长度大大缩短，降低了扩散传质阻力；n色谱色谱操作线速度大于操作线速度大于500 cm/h柱效柱效n色谱色谱柱效的普遍化公式为柱效的普遍化公式为n在在u 很大时，很大时，n其中其中n因此因此（4）介质制备介质制备nPOROS流通流通色谱色谱介质介质 该制备方法是首先合成微球，然后通过聚集形成聚集体，最该制备方法是首先合成微球，然后通过聚集形成聚集体，最终经聚集体的再聚合形成所需粒径的分离介质终经聚集体的再聚合形成所需粒径的分离介质n联合致孔法联合致孔法 通过固、液联合致孔方法合成双分散孔型层析介质，该方法通过固、液联合致孔方法合成双分散孔型层

36、析介质，该方法适用范围广，合成方法简单；适用范围广，合成方法简单；n连续床连续床色谱色谱介质介质 以以色谱色谱柱为模具，在柱内原位合成多孔型聚合物单块，再经柱为模具，在柱内原位合成多孔型聚合物单块，再经适当的功能基化可用于分离适当的功能基化可用于分离POROS流通流通色谱色谱介质介质流通色谱流通色谱介质制备（介质制备（2）B.双孔微球（BiPB）A.微孔微球（MiPB）（孔径10-100 nm）荧光标记琼脂糖吸附剂的激光扫描共聚焦显微镜HETP vs.流速双峰孔径分布，为10100 nm和5003000 nm 高流速（40cm/min）下BiPB的动态容量和柱效约为MiPB的3倍 琼脂糖大孔介

37、质孔扩散系数提高1倍，静态容量提高40，动态容量提高50 在518cm/min的范围内柱效与流速无关，适合高速色谱分离蛋白质。（5）连续床优点连续床优点n连续床在柱内原位合成制备，避免了传统的连续床在柱内原位合成制备，避免了传统的颗粒填充床颗粒制备和层析柱的填充过程；颗粒填充床颗粒制备和层析柱的填充过程；n连续床介质在层析柱内为多孔型连续相，孔连续床介质在层析柱内为多孔型连续相，孔径在径在亚微米及微米级亚微米及微米级之间，在中、低压力下之间，在中、低压力下液体可高速通过连续床孔隙，液体可高速通过连续床孔隙，两相间发生对两相间发生对流传质流传质；n连续床介质为连续相，内部孔隙率连续床介质为连续相

38、，内部孔隙率可达可达0.8以以上上，提高了层析柱的有效利用空间。，提高了层析柱的有效利用空间。11、置换、置换色谱色谱学习要点学习要点n理解理解：置换色谱技术的原理及操作，：置换色谱技术的原理及操作，n应用应用：了解置换色谱技术的应用范围及优缺点：了解置换色谱技术的应用范围及优缺点 （1）置换置换色谱色谱原理原理n置换置换色谱色谱基于置换剂与吸附质间在吸附剂表面的竞基于置换剂与吸附质间在吸附剂表面的竞争性吸附；争性吸附；n载液平衡的层析柱添加一定量料液，料液中溶质吸载液平衡的层析柱添加一定量料液，料液中溶质吸附于入口处。附于入口处。n连续输入含有置换剂的溶液，置换剂与固定相表面连续输入含有置换

39、剂的溶液，置换剂与固定相表面结合位点的亲和力比料液中的各组分都要高，其与结合位点的亲和力比料液中的各组分都要高，其与料液中各组分竞争固定相的结合位点，将吸附的溶料液中各组分竞争固定相的结合位点，将吸附的溶质置换下来；质置换下来；n同样，吸附作用强的溶质也会竞争吸附作用弱溶质同样，吸附作用强的溶质也会竞争吸附作用弱溶质所占据的位点，推动其向出口移动；所占据的位点，推动其向出口移动；置换置换色谱色谱原理（原理（2）n在在优惠吸附优惠吸附系统中，如果系统中，如果色谱色谱柱足够长，各组分按其柱足够长，各组分按其与固定相亲和力的大小顺序形成彼此相连的与固定相亲和力的大小顺序形成彼此相连的纯组分区纯组分区

40、带带；n由于置换剂的移动速度一定，故各组分区带的移动速由于置换剂的移动速度一定，故各组分区带的移动速度也为定值，形成度也为定值，形成“等速置换列等速置换列”；n如果一种组分由于某种原因进入到如果一种组分由于某种原因进入到置换置换色谱色谱原理示意原理示意（2）置换置换色谱色谱特点特点n与一般的洗脱与一般的洗脱色谱色谱经常出现的经常出现的拖尾现象拖尾现象相比，置换列中各溶相比，置换列中各溶质区带的边界陡直，因此置换层析的质区带的边界陡直，因此置换层析的分辩率高分辩率高；n置换置换色谱色谱具有浓缩作用具有浓缩作用，并可通过调节置换剂浓度控制分，并可通过调节置换剂浓度控制分离产品的浓度，处理量大，并特

41、别适用于处理稀料液；离产品的浓度，处理量大，并特别适用于处理稀料液；n置换列中各组分区带紧密相连，层析柱置换列中各组分区带紧密相连，层析柱利用率高利用率高，流动相，流动相用量少；用量少；n与亲和与亲和色谱色谱专一性纯化单一目标产物相比，置换层析同时实专一性纯化单一目标产物相比，置换层析同时实现多个目标产物的分离纯化，现多个目标产物的分离纯化，适于含有多个目标产物料适于含有多个目标产物料液的分离液的分离；n与梯度洗脱与梯度洗脱色谱色谱相比，置换相比，置换色谱色谱过程中料液、置换剂和再生过程中料液、置换剂和再生剂均以简单阶跃函数的形式输入，剂均以简单阶跃函数的形式输入，容易进行连续色谱分容易进行连

42、续色谱分离离；12、吸附色谱n n原理原理:利用溶质与吸附剂之间的分子吸附力利用溶质与吸附剂之间的分子吸附力(范德华范德华力，包括色散力、诱导力、定向力以及氢键力，包括色散力、诱导力、定向力以及氢键)的差的差异而实现分离异而实现分离n n关键要素：吸附剂和展开剂的选择关键要素：吸附剂和展开剂的选择n n吸附剂：氧化铝、硅胶、聚酰胺等，均含有不饱和吸附剂：氧化铝、硅胶、聚酰胺等，均含有不饱和的氧原子或氮原子以及能够形成氢键的基团，如的氧原子或氮原子以及能够形成氢键的基团，如-OHOH和和-NH-NH2 2Adsorption chromatographyn n常用的吸附剂：常用的吸附剂：n n氧

43、化铝氧化铝 n n硅胶硅胶n n活性炭活性炭n n纤维素纤维素n n聚酰胺聚酰胺n n硅藻土硅藻土展开剂的选择n n展开剂极性越大，对同一化合物的洗脱能力越大展开剂极性越大，对同一化合物的洗脱能力越大n n因此，可以根据实验结果调整展开剂的极性以获因此，可以根据实验结果调整展开剂的极性以获得最佳的分离的效果得最佳的分离的效果n n展开剂选择的原则：展开剂选择的原则：（1 1）对被分离组分应具有一定的解吸附能力，极）对被分离组分应具有一定的解吸附能力，极性应比被分离物质的极性略小性应比被分离物质的极性略小（2 2）展开剂应对被分离物质具有一定的溶解能力）展开剂应对被分离物质具有一定的溶解能力一般

44、吸附色谱的操作程序n n根据要分离组分的性质（包括极性、分子量、根据要分离组分的性质（包括极性、分子量、分子结构）选择合适的固定相和流动相分子结构）选择合适的固定相和流动相n n吸附操作：选择合适的操作条件（温度、吸附操作：选择合适的操作条件（温度、pHpH值、值、流速），进行装柱、平衡、上样，测定穿透样流速），进行装柱、平衡、上样，测定穿透样品含量以调整操作参数品含量以调整操作参数n n洗脱：采用有机溶剂洗涤、调节洗脱：采用有机溶剂洗涤、调节pHpH值以及体系值以及体系离子强度，最大限度地回收目标产物离子强度，最大限度地回收目标产物12、分配色谱n n原理：利用溶质在固定相和流动相之间的分配

45、原理：利用溶质在固定相和流动相之间的分配系数不同而分离的方法系数不同而分离的方法n n要素：固定相、载体、流动相要素：固定相、载体、流动相n n载体：通常为惰性材料，能吸附固定相液体载体：通常为惰性材料，能吸附固定相液体n n载体种类：载体种类：n n硅胶硅胶n n硅藻土硅藻土n n纤维素纤维素n n葡聚糖凝胶葡聚糖凝胶n n固定相：通常选取各组分溶解度大的溶剂作为固定相：通常选取各组分溶解度大的溶剂作为固定相固定相n n详见详见P247P247n n流动相可以是流动相可以是极性的极性的（反相色谱反相色谱法），也可以法），也可以是是非极性非极性的（的（正相色谱正相色谱）*反相色谱固定相是非极性

46、的反相色谱固定相是非极性的,流动相是极性的流动相是极性的HPLCHPLC Chromatogram反相液相色谱n n反相液相色谱分离多肽和蛋白质使基于蛋白质反相液相色谱分离多肽和蛋白质使基于蛋白质的疏水性，因此通常采用非极性的烷基固定相的疏水性，因此通常采用非极性的烷基固定相作为填料，其表面化学性质和流动相的选择应作为填料，其表面化学性质和流动相的选择应最大限度地满足疏水的要求最大限度地满足疏水的要求n n通常在流动相中加入离子对试剂（三氟乙酸）通常在流动相中加入离子对试剂（三氟乙酸）来增大蛋白质和多肽的疏水性来增大蛋白质和多肽的疏水性n n载体：微粒多孔硅胶（粒径载体：微粒多孔硅胶（粒径5m

47、20 m 5m20 m）Hypersil Spherosil XOB075Hypersil Spherosil XOB075n n固定相：固定相：C C1818、C C8 8烷基链，烷基链，C C8 8适于分离蛋白质适于分离蛋白质 C18C18适于分离核酸适于分离核酸 苯基苯基n n流动相的选择流动相的选择 通常采用有机溶剂，乙腈、异丙醇、正丙醇和通常采用有机溶剂，乙腈、异丙醇、正丙醇和四氢呋喃四氢呋喃Source RPC30m15m5mInfluence of Particle Size on the Separation effect离子交换色谱n n以离子交换树脂作为固定相，选择合适的溶

48、剂以离子交换树脂作为固定相，选择合适的溶剂作为流动相，使溶质按照其离子交换亲合力的作为流动相，使溶质按照其离子交换亲合力的不同而得到分离的方法不同而得到分离的方法常用的离子交换树脂n n葡聚糖凝胶型葡聚糖凝胶型 DEAE-Sephadex A-25DEAE-Sephadex A-25，QAE-Sephadex A-25QAE-Sephadex A-25，CM-Sephadex C-25CM-Sephadex C-25，SP-Sephadex C-25SP-Sephadex C-25n n纤维素系列离子交换剂纤维素系列离子交换剂 DEAE-Sephacel CellexDEAE-Sephacel

49、 Cellex系列系列 n n琼脂糖系列离子交换剂琼脂糖系列离子交换剂 SepharoseSepharose系列系列 Sepharose CL-6B,Sepharose Sepharose CL-6B,Sepharose Fast FlowFast Flow Bio-Gel A Bio-Gel A 系列交联琼脂糖离子交换剂系列交联琼脂糖离子交换剂n nSource Source 系列离子交换剂系列离子交换剂n n特点：介质均匀、分辨率高、流速快、反压低特点：介质均匀、分辨率高、流速快、反压低n n阳离子交换树脂阳离子交换树脂 S S系列系列n n阴离子交换树脂阴离子交换树脂 Q Q系列系列n

50、nMonoBeads MonoBeads 系列离子交换剂（系列离子交换剂（PharmaciaPharmacia）n n特点：介质为亲水性聚醚，具有和特点：介质为亲水性聚醚，具有和SourceSource系列相系列相同的优点，但动态载量更大，寿命更长。同的优点，但动态载量更大，寿命更长。n n同样分为同样分为Q Q系列和系列和P P系列系列Mini Q PC 3.2/3:Glutathione synthetaseSDS-PAGEStarting materialPeak 2Expanded Bed分子筛凝胶色谱n n在样品通过一定孔径的凝胶固定相时，由于流在样品通过一定孔径的凝胶固定相时，由于