化学发光成像系统及其实用技术.ppt

1、临床检验诊断学教育部重点实验室xxx 教授1.复习化学发光的基本知识2.化学发光成像系统的应用3.化学发光成像系统的发展4.化学发光成像系统的结构5.化学发光成像系统的操作6.化学发光成像系统的注意事项7.Western Blot常见问题分析化学发光（CL）是某种物质分子吸收化学能而产生的光辐射。一个化学反应要成为发光反应，必须满足两个条件：第一：反应必须提供足够的能量（170300 KJ/mol）第二，这些化学能必须能被某种物质分子吸收而产生电子激发态，并且有足够的荧光量子产率。依据供能反应的特点，可将化学发光分析法分为：1）普通化学发光分析法(供能反应为一般化学反应)；2）生物化学发光分析

2、法(供能反应为生物化学反应；简称 BCL)；3）电致化学发光分析法(供能反应为电化学反应，简称 ECL)等。1 鲁米诺及其衍生物2 光泽精3 洛粉碱4 过氧化草酸酯类5 吖啶酯类灵敏：化学发光免疫分析方法的检测灵敏度要远远高于ELISA、荧光免疫等，而优于或与同位素检测相当；方便：在使用方便性上，化学发光与传统ELISA方法一样简单易用；安全：在对人体和环境的危害上，化学发光对此没有任何担忧。无机化合物化学发光分析无机化合物化学发光分析有机化合物的化学发光分析有机化合物的化学发光分析化学化光在生物领域的应用化学化光在生物领域的应用1.1.金属离子分析金属离子分析2.2.其它无机化合物的分析其它

3、无机化合物的分析有机酸有机酸 有机碱有机碱氨基酸氨基酸糖类糖类类固醇与类酯类固醇与类酯药物药物高灵敏度使得它非常适合于微小化的生物分析装置，以用于小量样品体积的基因和蛋白的高通量筛选。体外和体内连续检测生物过程，可应用于临床、诊断、和药物开发等。结合发光酶或某些在基因水平有生物特异结合位点的发光蛋白发展了超敏感和选择性的生物分析工具。液相样品的检测-化学发光分析仪固相样品的检测-化学发光成像仪采用电化学发光免疫技术，被特殊标记物标记的抗体（抗原）与待检测抗原（抗体）结合后，与参与反应物在电极上发生一系列的反应并释放出光子后，通过光电倍增管检测光信号，并通过计算机的计算分析，得出结果新的BL/C

4、L生物技术工具向微型化、自动化的方向发展1、免疫检测、免疫检测化学发光已经广泛的应用到免疫检测中进行标记物的超灵敏检测。CL免疫检测不但可以通过以CL分子直接标记抗原或抗体，也可以以CL底物标记可被检测的酶。2、基因表达、基因表达体内基因表达模式方面的研究。在药物研发领域，科学家通过可发光转基因动物（例如：大鼠或小鼠基因组中整合了修饰的内源基因和BCL报告基因）作为人类疾病的模式动物进行目标确认的研究。3、组织切片和单细胞、组织切片和单细胞原位CL(化学发光)杂交检测方法是基于标记的寡核苷酸探针与目标核酸序列特异性原位杂交，再进行CL检测。这种方法不但可以定位还可以定量检测在细胞或组织中目标序

5、列的数量。使用特异性的地高辛标记基因探针在一个皮肤组织切片中检测到了人乳突淋瘤病毒（HPV）DNA。地高辛抗体会与碱性磷酸酯酶和CL酶底物结合。通过CL原位杂交揭示了HPV DNA的浓度从上皮细胞层底部到表面逐渐增加，这一现象正好与病毒的复制循环相吻合。左图显示的是透射光图象，中图是CL信号，右图显示的是透射光透射图层与CL图象假色图层4、离体器官灌流、离体器官灌流作为一种简单而可靠的模式，分离并灌注器官被广泛的应用在各种生物学功能的研究方面。BL/CL成像已经被应用到病生理过程的ex vivo研究中。5、动物、动物体内体内监测监测BL/CL反应所产生的可见光可以部分的透过动物组织，因此可以在

6、整体动物的模式下进行成像。6、肿瘤研究、肿瘤研究研究肿瘤的生长与转移，可以通过活体中注射BL重组肿瘤细胞，再成像进行监测。另一种方式，初期的肿瘤和不确定的转移可以通过使用基因工程的发光细胞作为探针进行定位。7、细胞移植、细胞移植心脏细胞移植中胚胎心脏成肌细胞的位置、数量和存活时间可以在活体动物中进行非侵入行的监测。体内BL成像同样提供了一种新的可以动态检测移植的人造血干细胞的方法。8、传染性疾病、传染性疾病疾病的进程和治疗剂的功效可以通过对小鼠注射BL标记进行评估。例如注射经过修饰的病原微生物，然后对透过动物组织的光进行成像。9、其他、其他其他的生物学过程同样可以通过BL标记后活体成像进行研究

7、，比如细胞凋亡、蛋白-蛋白互作和效应细胞功能等等。感光胶片冷CCD感光胶片它已经被认为是对固定在膜上的蛋白或核酸进行化学发光检测的强有力的工具，如Southern、Northern和Western杂交的化学发光检测。环境要求高操作要求严时间较长弱光成像设备是基于超高灵敏度的CCD相机可以检测到由样品表面发生特定的反应后发射出来的光。这些设备不但可以在单分子水平定量发光的强弱，还可以进行定位。CCD成像技术：基于CCD的影像系统已成为化学发光印迹结果获得和记录的好工具。这些系统在信号测试的动态范围上表现出很好的效果。1.环境要求低2.操作要求简单3.摄像时间短，并且可以获得多个影像和容易存储4.

8、灵敏度高，CCD的量度大小为34个级数，而X光片仅为1个级数Cool ImageChemiDoc XRSu全密封一体式暗箱u 冷却CCDu操控面板u 光源及激发光源（荧光）u 多位滤镜轮u 图像捕获系统u图像分析系统1、密闭要好，不能有外界光线的干扰2、内壁涂层均匀，尽量减少反光制冷-20 -40，否则长时间曝光会出现噪点光圈焦距缩放光源CCD制冷电源读 卡 器可选择不同波长的滤光片，以进行荧光成像配备不同波长的光源以满足荧光发光的需要。白光用于聚焦。1.打开电源打开显示器打开仪器主机2.打开图像捕获软件3.选择适合的滤镜4.将准备好的化学发光底物均匀覆盖已标记好二抗的膜上(注意要在膜的正面)

9、5.在软件工具栏中选择special菜单中的startcapturing6.将膜放入暗箱，打开白光光源（A），打开CCD（CAMERA），调节光圈大小（IRIS），调节图像大小（ZOOM），调节镜头聚焦（FOCUS）直至清晰7.关闭光源，将光圈调至最大，打开COOL按键，在软件工具栏中选择special菜单中的Average Frames8.输入累积帧数（最大9999，30帧/秒），选择IntegrateOn-chip，点击OK9.等待，直至鼠标双箭头消失10.在File菜单中选择保存图像（格式最好选用TIF）11.关闭CCD，关闭制冷12.图象的处理和分析（quantity_one）详见qu

10、antity_one使用指南仪器使用方面的问题实验过程中的问题(Western Blot)分清膜的正反面图像采集前必须聚焦未关闭光源未打开制冷开关曝光时间过长及时关闭CCD和制冷开关（延长仪器使用寿命）分清膜的正反面图像采集前必须聚焦未关闭光源未打开制冷开关曝光时间过长样品制备电泳转膜封闭一抗二抗显色根据样品的不同来源，选择适应的提取，纯化方法1.目的蛋白分子量太大跑不动降低降低胶浓度（选用梯度胶），降低离子强度，加大电流电压，延长电泳时间T为凝胶浓度，C为交联度其中：a为丙烯酰胺的克数，b为甲叉双丙烯酰胺的克数，m为缓冲液体积（ml）当C恒定时，凝胶的有效孔径随着T的增加而减小；当T保持恒定

11、，C为4%时，有效孔径最小，C大于或小于4%时，有效孔径均变大，C大于5%时凝胶变脆，不宜使用，实验中最常用的C是2.6%和3%带电颗粒的大小和形状：颗粒越大，电泳速度越慢，反之越快；颗粒的电荷数：电荷越少，电泳速度越慢，反之越快；溶液的粘度：粘度越大，电泳速度越慢，反之越快；溶液的pH值：影响被分离物质的解离度，离等电点越近，电泳速度越慢，反之越快；电场强度：电场强度越小，电泳速度越慢，反之越快；离子强度：离子强度越大，电泳速度越慢，反之越快；电渗现象：电场中，液体相对于固体支持物的相对移动；支持物筛孔大小：孔径小，电泳速度慢，反之则快。Q：提高SDS-PAGE电泳分辨率的途径？A：1、聚丙

12、烯酰胺的充分聚合，可提高凝胶的分辨率。建议做法：待凝胶在室温凝固后，可在室温下放置一段时间使用。忌即配即用或4度冰箱放置，前者易导致凝固不充分，后者可导致SDS结晶。一般凝胶可在室温下保存4天，SDS可水解聚丙烯酰胺。2、一般常用的有氨基黑、考马斯亮蓝、银染色三种染料，不同染料又各自不同的染色方法。Q：“微笑”（两边翘起中间凹下）形带原因？A：主要是由于凝胶的中间部分凝固不均匀所致，多出现于较厚的凝胶中。处理办法：待其充分凝固再作后续实验。Q：“皱眉”（两边向下中间鼓起）形带原因？A：主要出现在蛋白质垂直电泳槽中，一般是两板之间的底部间隙气泡未排除干净。处理办法：可在两板间加入适量缓冲液，以排

13、除气泡。Q：为什么带出现拖尾现象？A：主要是样品融解效果不佳或分离胶浓度过大引起的。处理办法：加样前离心；选择适当的样品缓冲液，加适量样品促溶剂；电泳缓冲液时间过长，重新配制；降低凝胶浓度。Q：为什么带出现纹理现象？A：主要是样品不溶性颗粒引起的。处理办法：加样前离心；加适量样品促溶剂。2.蛋白上样量不足或样品中目的蛋白的含量低样品浓缩纯化提高上样量，选用厚胶,保证目的蛋白的量在一抗的检测范围内；上样量也不能太多，会出现条带弯曲3.电泳结果检查（选择切胶范围）考马斯亮蓝使用简便快速，可以分辨1ug左右的条带，银染操作复杂但分辨率高，可以分辨2-5ng蛋白。可是由于考染或者银染经过固定不可逆结合

14、，会干扰后面的Western Blot实验。同样的样品多跑几孔胶，一半快速染色一半转膜。用SYPRO Tangerine这种金色荧光蛋白染料灵敏度很高检测4ng-8ng蛋白，接近银染，但使用非常简单，不干扰蛋白活性，特别适合Western转膜前的染色。使用预染Marker，预测条带的位置1.转膜方式的选择半干转：时间短，产热大，容易造成蛋白的损失。大分子转膜的首选（应使用专用转膜滤纸）湿转：时间长，可控制转膜温度，蛋白损失较小。小分子尽量选择这种方式2.膜的选择(见下表)NC膜膜尼龙膜尼龙膜PVDF膜膜灵敏度和分辨率高高高背景低较高低结合能力80110 ug/cm2400 ug/cm21252

15、00 ug/cm2（适合于SDS存在下与蛋白质的结合）材料质地干的NC膜易脆软而结实机械强度高溶剂耐受性无无有操作程序缓冲液润湿,避免气泡缓冲液润湿使用前100%甲醇润湿（不能超过15秒）检测方式常规染色，可用放射性和非放射性检测不能用阴离子染料常规染色，比较于NC膜，可用考马斯亮蓝染色，可用于ECL检测，快速免疫检测。3.转膜条件滤纸-胶-膜-滤纸之间一定不能有气泡。要使用专用转移电泳仪才能承受足够大的电流。湿转应注意不能超过电泳槽能承受的最大电流。半干转电压不能超过25V。时间不能过长，否则会大量产热烧毁PVDF膜。半干转可用均一缓冲体系，也可以做非均一转移缓冲体系。4.转膜结果检查预染M

16、arker丽春红S，直接染色转移膜，检测转膜效果，充分脱色后不干扰Western结果。转印后的PVDF膜在含20%甲醇溶液中,在白透射光照下不用染色也依稀可以看到透明的蛋白条带。转膜后，膜上其他的空白位置需要用封闭液封闭。Western的灵敏度某种程度上受限于封闭做的好不好。封闭时间和封闭剂的量都要足够。5%脱脂奶粉TBST封闭液会影响亲和素生物素的生成，不适合生物素亲和素的检测方法，也不适合碱性磷酸酶检测（AP）方法。可用BSA替代碱性磷酸酶检测（AP）方法，封闭时就要选择Tris缓冲体系，不要用PBS，因为PBS干扰AP。叠氮钠(NaN3)对辣根过氮化物酶(HRP)有灭活作用，如果用HRP

17、检测系统则封闭液不要加叠氮化钠为好。单抗专一性高，但是经过SDS-PAGE变性胶电泳的蛋白质可能由于原来的识别位点构象发生改变而不被识别，多抗不如单抗专一性高但更容易得到结果。抗体源于兔或者小鼠抗体为好一抗的稀释度通常需要预实验摸条件，可以根据说明书上建议的WB稀释度附近做23个梯度，如果是用化学发光法检测，由于灵敏度高而建议将稀释度再放大一些。二抗除了要选择对应一抗的来源种属，也要根据你准备采用的检测方法选择合适的标记。(HRP、ALP，生物素等)二抗浓度不宜过高背景深浅与一抗的质量及二抗的量有关，CL时抗体一定要比底物显色法中稀释更多倍数，不然会造成背景高Luminol是经典的HRP化学发光底物。产品选择：背景低；强度高；持续时间长GE公司：ECL Advance/ECL/ECL PlusPierce公司：SuperSignal系列底物的量不宜过多，不能在膜上流动复习化学发光的基本知识化学发光成像系统的应用化学发光成像系统的发展化学发光成像系统的结构化学发光成像系统的操作化学发光成像系统的注意事项Western Blot常见问题分析