第5章--生物物理技术-微操控技术.doc

1、第5章 微操控技术摘要： 分子生物学的兴起使生命科学逐渐摆脱了以描述性为主的研究模式，深入到分子水平，揭示生命现象的本质。尽管生命系统十分复杂，人们还是习惯于以单分子之问的相互作用来思考问题和构建模型。与此相对应，人们一直期待着能够在单分子水平直接研究基本的生命过程。自上世纪90年代以来发展起来的单分子研究技术如光镊、磁镊、玻璃微管和分子梳等，再加上单分子荧光技术，使人们能够直接操纵并检测单个分子的运动及变化，或通过施加外力改变生化反应的进程，研究化学能与机械能之间的相互转化。本文主要介绍了三种细胞和分子的微操控技术的原理和应用领域：膜片钳技术、光镊技术和磁镊技术和其他相关技术，并对它们进行了

2、简单的比较。关键词：膜片钳（Patch Clamp） 光镊（Optical Tweezers） 磁镊（Magnetic Tweezers） 目录1. 膜片钳技术（Patch Clamp）21.1. 膜片钳技术的原理21.2. 膜片钳实验的纪录模式21.3. 膜片钳技术的应用31.3.1. 对离子通道的研究31.3.2. 对单细胞形态与功能关系的研究31.3.3. 对药物作用机制的研究41.3.4. 对细胞胞吞胞吐的研究41.3.5. 膜片钳技术与荧光技术的结合51.3.6. 全自动膜片钳技术52. 光镊技术（Optical Tweezers）52.1. 光镊技术的原理52.2. 光镊的技术特点

3、62.3. 光镊技术的应用62.3.1 单粒子的捕获与操控62.3.2 位移和力的测量72.3.3 光镊技术适合解决的生物学问题83. 磁镊技术（Magnetic Tweezers）93.1. 磁镊技术的原理93.2. 磁镊技术的应用94. 其它微操控技术104.1. 原子力显微镜104.2. 玻璃微针104.3. 斯托克斯拖曳104.4. 生物膜力探针（BFP）104.5 各种单分子微操控技术的比较105. 总结与展望12参考文献：121. 膜片钳技术（Patch Clamp）细胞是构成生物体的基本单位。在细胞的外周有一层以脂类和蛋白质分子为主要成分的细胞膜，在细胞膜上存在有多种离子通道，细

4、胞通过这些通道与外界进行物质、能量和信息的交流（如图1(a)）。离子通道是细胞兴奋性的基础，在细胞内及细胞与细胞之间的信号传递中起着非常重要的作用。对离子通道的研究来源于生理学实验，英国学者Huxley和Katz最早应用电压钳来研究细胞膜上离子通道的电流变化，但由于该技术对细胞的损伤大，难以使细胞膜各处的生理特性保持一致，因而逐渐被膜片钳技术所取代。膜片钳技术为生物膜离子通道的门控动力学研究和不同离子通道的通透性以及细胞的生理特性研究提供了直接的手段。（曹建斌2009）图1 膜片钳技术的原理1.1. 膜片钳技术的原理膜片钳技术（patch-clamp technique）是在电压钳技术的基础上

5、发展起来的，采用记录流过离子通道的离子电流，来反映细胞膜上单一的（或多个的）离子通道分子活动的技术（曹建斌2009）。膜片钳技术是用微玻管电极（尖端直径约1-5）接触细胞膜而不刺人，然后在微电极另一端开口施加适当的负压，将与电极尖端接触的那一小片膜轻度吸人电极尖端的纤细开口，这样在这小片膜周边与微电极开口处的玻璃边沿之间，会形成紧密的封接（gigaohm seal），在理想的情况下其电阻可达数个或数十个千兆欧姆（109 ）以上的阻抗封接，使与电极尖开口处相连的细胞膜的小区域（膜片）与其周围的细胞膜在电学上完全分隔，如果在这一小片膜中只包含了一个或少数几个通道蛋白质分子，那么通过此微电极就可测出

6、单一通道开放时的离子电流和电导，并能对单通道的其他功能特性进行分析（田晶 2008）。1976年，德国生理学家Neher和Sakmann首先利用此技术研究肌肉细胞膜上的乙酰胆碱受体通道，记录出了量值在皮安级（10-12A）的微弱电流（Neher, et al. 1976）。1.2. 膜片钳实验的纪录模式 包括两大类四种（如图2）：第一大类单通道记录（single-channel recording）包括三种：（1）细胞吸附式（cell-attached patch）将两次拉制后，经热抛光的微管电极置于清洁的细胞膜表面，形成高阻封接，在细胞膜表面隔离出一小片膜，即通过微管电极对膜片进行电压钳制，

7、从而测量膜电流。（2）内面向外模式（inside-out patch）高阻封接形成后，将微管电极轻轻提起，使其与细胞分离，电极端形成密封小泡，在空气中短暂暴露几秒钟后再回到溶液中，使小泡的外半部分破裂即得。（3）外面向外模式（outside-out patch）高阻封接形成后，继续以负压抽吸，膜片破裂，再将电极慢慢从细胞表面提起，断端游离部分自行融合成脂质双层而得到。第二大类即全细胞模式（whole-cell mode）在细胞吸附式的基础上，继续以负压抽吸，使电极管内细胞膜破裂，电极内液与胞内液直接相通而得到，此方式既可记录膜电位又可记录膜电流，反映的是整个细胞膜上所有离子通道电活动的总和。（

8、林燕飞 2008）图2 膜片钳实验的记录模式(a)细胞贴附式(b)全细胞式(C)内面向外式(d)外面向外式1.3. 膜片钳技术的应用从1976年德国生理学家Neher和Sakmann首先建立膜片钳技术以来，该技术获得了快速的发展，已成为现代细胞电生理学研究中的常规方法，并逐步完善和发展出许多新的技术。1.3.1. 对离子通道的研究应用膜片钳技术可以直接观察和分辨单离子通道电流及其开闭时程、区分离子通道的离子选择性、同时可发现新的离子通道及亚型，并能在记录单细胞电流和全细胞电流的基础上进一步计算出细胞膜上的通道数和开放概率，还可以用以研究某些胞内或胞外物质对离子通道开闭及通道电流的影响等。同时用

9、于研究细胞信号的跨膜传导和细胞分泌机制。结合分子克隆和定点突变技术，膜片钳技术可用于离子通道分子结构与生物学功能关系的研究。（宋孟杰 2009）1.3.2. 对单细胞形态与功能关系的研究随着分子生物学的迅速发展和推广应用，膜片钳技术与单细胞逆转录多聚酶链式反应技术（single cell RT-PCR）的结合，是神经科学研究中的一个重要发展方向（蒋娟 2002）。在全细胞膜片钳记录下，将单细胞内容物或整个细胞（包括细胞膜）吸入电极中，将细胞内存在的各种mRNA 全部快速逆转录成cDNA，再经常规PCR 扩增及待检的特异mRNA的检测，借此可对形态相似而电活动不同的结果做出分子水平的解释或为单细

10、胞逆转录多聚酶链式反应提供标本，为同一结构中形态非常相似但功能不同的事实提供分子水平的解释。目前国际上掌握此技术的实验室较少，北京大学神经科学研究所于1994年率先在国内开展。图3 膜片钳技术与RT-PCR联合运用的例子（Takashi Miki, et al. 2001）1.3.3. 对药物作用机制的研究在通道电流记录中，可分别于不同时间、不同部位（膜内或膜外）施加各种浓度的药物，研究它们对通道功能的可能影响，了解那些选择性作用于通道的药物影响人和动物生理功能的分子机理。这是目前膜片钳技术应用最广泛的领域，既有对西药药物机制的探讨，也广泛用在重要药理的研究上。如开丽等报道细胞贴附式膜片钳单通

11、道记录法观测到人参二醇组皂苷可抑制正常和“缺血”诱导的大鼠大脑皮层神经元L-型钙通道的开放，从而减少钙内流，对缺血细胞可能有保护作用。陈龙等报道采用细胞贴附式单通道记录法发现乌头碱对培养的Wister 大鼠心室肌细胞L-型钙通道有阻滞作用。（宋孟杰 2009）1.3.4. 对细胞胞吞胞吐的研究 用膜片钳膜电容测量技术检测中性粒细胞膜电容的变化是一种有效研究单个细胞胞吐或胞吞的方法（刘东方 2004）。生物膜电容的两块平板由导电的细胞浆和细胞外液组成，借脂质双层膜作为绝缘体而分开。因此，细胞膜构成了一个电学上的电容器。细胞膜电容与细胞膜表面积相关。胞吞胞吐导致细胞膜表面积的暂时改变，从而改变膜电

12、容（图4(a)）。神经突触信号的传递，肌肉兴奋信号的传导，通常都与囊泡的大量释放有关，在淋巴细胞行使免疫功能过程中，通常会吞噬大量的抗原物质，所以，利用膜片钳技术研究胞吞胞吐作用是神经细胞生物学研究中的一个重要手段。另外，如今纳米技术快速发展，不少学者对纳米颗粒进入细胞的过程提出了假设或是进行了模拟（图4(b)，Yang Li 2008），从理论上来说，膜片钳技术也可以用来研究纳米颗粒的胞吞胞吐过程。 图4 膜片钳技术用于研究细胞胞吞胞吐1.3.5. 膜片钳技术与荧光技术的结合荧光探针Fura-2、Fluo-3、Fluo-4等常用于检测细胞内的钙离子浓度，其能与钙离子结合，产生较强的荧光，通过

13、膜片微电极将其引入细胞，可以利用膜片钳记录细胞内的钙离子浓度，钙离子的释放及内流等情况，研究细胞膜钙离子通道的开放、关闭的动力学特征及生理学效应。（曹建斌 2009）1.3.6. 全自动膜片钳技术 全自动膜片钳技术是离子通道检测的新技术，它具有直接性、高信息量及高精确性的特点。与常规的膜片钳技术相比，全自动膜片钳技术能够进行大量筛选，具有高通量性，并且高阻封接稳定，实验记录的精确性高，实现了操作过程的自动化。Sophion Bioscience公司研发了基于硅芯片系统的全自动膜片钳产品QPatch 96，能够持续运行直到实验完成，提高了离子通道药物筛选的效率。目前，该技术应用于以离子通道为靶标

14、的药物的筛选，药效的测试以及安全性研究等方面。（曹建斌 2009）2. 光镊技术（Optical Tweezers）激光光镊，亦称光镊或光阱，是用高度会聚的激光束形成的三维势阱来俘获、操纵控制微小颗粒的一项技术。由于光镊技术兼有微纳米尺度粒子的捕获和操纵功能，可以对微粒子的皮牛顿量级力进行测量，目前已广泛应用于生命科学、物理学和化学等研究领域。在生物医学领域，光镊技术在细胞及生物大分子的操控、静态力学性质研究和生物大分子生命过程中的动力学行为研究等方面发挥着巨大的作用。因为它对生物微粒的生命活动干扰极小，整个操作体系涉及的细胞生存环境几乎等同于“天然”环境，可以把生物微粒的生命活动变化完整保留

15、并“实时动态”地展现。另外，光镊技术使得生物微粒的生命过程成为可控的，可以对其生命活动中的任一环节进行人为调节，使对它们个体行为的研究真正上升到“操控阶段”。（张晓晖 2009）2.1. 光镊技术的原理 光镊的原理是建立在光的辐射力基础上的。量子理沦认为，光是一群以光速运动的光子流。光辐射场与物体的相互作用会使物体受到光辐射力的作用。光辐射力分为推动物体沿光传播方向的散射力和往光强密度高方向拉动物体的梯度力两种。当梯度力超过散射力时，微小颗粒即被吸引至光强密度最高点并被稳定地捕获在该点上。因此，实际应用中一般利用高数值孔径的物镜形成大空间梯度的光场从而形成一个稳定的光阱。当捕获在光阱中的颗粒离

16、开中心时会受到与其相对于中心位移成正比的回复力，就像拴在一根弹簧上（图3）。这个光学势阱如同传统的机械镊子，能夹持和操纵微小物体，所以称为光学镊子或简称光镊。利用光镊可实现对微粒的稳定捕获和操纵，以及进行微小力的测量。通常，将回复力与颗粒离开光束中心位移的比值称为光阱刚度k=F/x，刚度大小可以反映光阱捕获颗粒的稳定程度，同时也是光镊测量力时的重要参数。（张晓晖 2009）图3 (a)光镊原理：一束高斯激光经透镜聚焦后，入射到透明介质球上，经介质球两次折射后出射，此过程中光子动量发生变化，这种变化表现为对小球的反作用力。光束通过粒子时由于折射而引起动量交换，从而对被作用粒子施加一个指向光束焦点

17、的合力，使粒子总是趋于光束焦点，因而可稳定捕获微粒；(b) 光陷阱效应：直径为2微米的聚苯乙烯小球陷入光阱的过程。小球距离光阱的中心为R，阱域就是以R为半径的圆形区域。2.2. 光镊的技术特点： 1）光镊是以光场的形式与物体交换动量的结果，光镊是一种特殊的“无形”镊子，没有机械镊子夹持物体有集中的受力点，光镊的操作是非接触的、无损的。 2）光具有的穿透特性，光镊可以越过透明屏障，穿过封闭系统的表层（细胞膜）操控其内部微粒（细胞器），也可以透过封闭的样品池的外壁，操控池内微粒，实现真正的无菌操作。 3）光镊更多的是在液体中工作，能够保持细胞生存的“天然”环境。因此，光镊技术特别适合用于对活体生物

18、细胞、细胞器以及生物大分子的操控和研究。 4）光镊操控微粒的尺度在几十纳米到几十微米，这也是生物大分子、细胞器、细胞的尺度范围。在该尺度范围光镊是唯一的操作手。 5）光镊的所有机械部件离捕获对象的距离都远大于捕获对象的尺度（约1000倍），因此光镊是以“遥控”的方式，远距离工作的。 6）光镊操控微粒直接展现在显示屏，是可视性，完全暴露在我们视野中的细胞为研究者提供了进行下一步工作的极大方便。 目前还没有其它实验技术比光镊研究操控活体能如此得心应手。 7）光镊是微小力的探针。 光镊对微粒的操控不是刚性的，类似弹簧，在操作过程中能实时感应微小的负荷。因此，光镊是极其灵敏的力传感器，力的分辨精度高达

19、几飞牛。 8）光镊与其它技术手段结合，如常规显微镜所配置的荧光，相差，微针等，还有激光刀，近场光学显微镜，共聚焦显微镜，光谱仪等。（中科大激光生物实验室网页） 目前还没有能够直接深入到细胞内操控单分子的技术和方法，而光镊已实现了在体外操控单个大分子，实时追踪其运动，获取单分子静态和动态的力学性质等，成为生物学领域不可或缺的一种独立的技术。2.3. 光镊技术的应用2.3.1 单粒子的捕获与操控光镊的基本操作功能是对微小粒子的捕获和操控。捕获即夹持物体；所谓操控，就是使目标物体与所在环境实现相对运动，将捕获的目标物体挪动到新的目的地。基于“光镊微操作仪”的设计，目标物体与所在环境实现相对运动的方法

20、是固定光镊，操控目标物体所在环境，即通过操控样品台带动样品池中的样品运动。（中科大激光生物实验室网页）光镊操控微粒有两种方式。一种是直接操控（图4），光镊可直接操控的粒子从几十纳米到几十微米。 图4 (a) 光镊在横向（X-Y平面）操控微粒；(b) 光镊在纵向（Z轴）操控微粒；(c) 研究者用48个2微米的粒子逐个排列成“863”字样另一种是间接操控（图5），间接操控方法利用了光阱系统能清晰分辨的微米粒子作为“手柄”，将纳米微粒粘附在“手柄”上，使待测量的纳米微粒与小球刚性的连接，用光镊操控“手柄”达到操控纳米微粒的目的。这种间接操控法使光镊操控范围扩展到纳米尺度，已成为一种有效的单分子纳米操

21、控技术。图5光镊间接操控纳米微粒和生物大分子：“手柄”采用1微米的聚苯乙烯小球，将被测的纳米微粒黏附在“手柄”表面，通过测量“手柄”受到的力和产生的位移，计算纳米微粒运动参数。2.3.2 位移和力的测量 光镊能够捕获和操控物体，实际上是光施加给物体一个作用力，所以，光镊也是力的测量工具。光镊力的性质：形成光镊的光势阱中心附近的势场近似简谐势，光镊捕获粒子类似于弹簧，所以光镊是极其灵敏光力传感器，它能感受飞牛(fN)力的负荷。光镊因具有飞牛力分辨的精度而成为介观领域研究微小粒子静态和动态力学特性的理想工具。美国标准和技术局在2008年授予了一项利用光镊检测生物分子技术的专利（图7），该技术相比于

22、传统的抗原抗体检测手段具有更高的灵敏度。（Science Daily网站）图6 光镊力的性质图7 光镊用于检测生物颗粒示意图：在基板上固定抗体，并将与微球结合的特异性抗原与之反应，通过光镊施加微小作用力使抗原-抗体连接键断裂，作用力的大小反应了抗原抗体间的结合程度。2.3.3 光镊技术适合解决的生物学问题捕获并操控微粒是光镊最基本的功能，而生物细胞的尺度正好适合于光镊操控。光镊可以使传感的被动观察变为主动操控研究。以利于在单细胞层次上研究细胞生命活动。另外，生命过程中存在着许多微小后的机械运动及分子或细胞问机械力的相互作用，例如分子马达携带分子货物沿细胞骨架的行走，核苷酸链的转录和复制，蛋白质

23、结构域的折叠等。通常，分子马达的8nm行走步长，0.34nm的双链DNA中相邻碱基对的距离，以及几到几十个纳米的蛋白折叠过程都无法用传统的实验方法所观测。因此光镊就成为观察这些生物学过程的理想工具。其应用主要集中在以下几个方面：1）对生物微粒进行固定，悬浮，分选（图8）；2）研究生物微粒的静态力学特性；3）研究生物微粒的动态力学特性；4）对生物大分子进行精细操作；5）细胞表面相互作用测量。（张晓晖 2009）图8 光镊分选水稻单条染色体：(a)激光刀作用后的细胞残骸；(b)光镊捕获单条染色体；(c)光镊操控染色体移动到微针附近；(d)微针收集染色体3. 磁镊技术（Magnetic Tweeze

24、rs）3.1. 磁镊技术的原理 磁镊方法是将生物分子（一般是DNA）的一端连在小球或玻璃表面上，另一端连上一个超顺磁性小球（简称磁球），外加一个磁场吸引住磁球，改变外磁场就可以拉动或转动磁球，从而拉伸或扭转DNA分子（图9）。单分子磁镊又可以分为纵向磁镊和横向磁镊，其中纵向磁镊方法是通过小球像的光晕的变化来测量磁球与载玻片表面的距离，即单分子DNA的拉伸长度，这种方法实验时样品池溶液可更换，具有较高的实验效率；而近场横向磁镊装置能够直观方便地观察并检测单个DNA分子的伸展长度，同时具有较高的精确度。（王晓玲 2008）图9 磁镊技术的原理3.2. 磁镊技术的应用单分子磁镊技术的应用和光镊相似，

25、可以对DNA分子进行单分子操纵，如拉伸、旋转，研究DNA分子的力学性质，如双链螺旋的形成和解旋机制，DNA复制过程，DNA发卡结构的形成等等所有和DNA行为有关的分子过程（图10）。DNA的拉伸、旋转和解链技术还可以用来研究DNA与蛋白质的相互作用。这些实验都相当精细，充满了新奇和挑战性，让人在惊叹生命单元独特构造的同时，也不得不佩服人类探索自然奥秘的勇气和将它付之于实践的智慧。（冉诗勇 2006）图10(a) DNA双连的拉伸曲线；(b) 在不同力作用下DNA的长度一转数曲线4. 其它微操控技术常用的单分子操纵技术除了光镊和磁镊，还有原子力显微镜（AFM）、玻璃微针，流场拖曳和生物膜力探针(

26、BFP)等等。（冉诗勇 2006；施兴华 2004）4.1. 原子力显微镜原子力显微镜（AFM）通过机械弹簧的变形来测量力的大小。其作为探针的玻璃微丝硬度通常在10-5 Nm-1，位移的辨析度在10 nm，那么所能测到的力为10-2 pN。但是此时产生的Langevin力约0.5 pN Hz-1/2，快速测量的频率10100 Hz，所以力的精度在几个皮牛量级。4.2. 玻璃微针利用商业拉针仪器，可以拉出比原子力显微镜微悬臂的弹性系数更小的微针尖。将针尖进行修饰连接上DNA的一端，另一端连在一个可移动的精密样品台上。样品台拉伸DNA并使针尖偏转，偏转量可以用来计算力。4.3. 斯托克斯拖曳斯托克

27、斯拖曳是通过水的流动将力施加于连有DNA的小球上。用两块玻璃片密封形成样品腔，并在上面的玻璃片上开两个小孔连上细导管，以输入生化样品或更换缓冲液通常将生物分子的一端固定在被修饰过的玻璃基底上，而另一端固定在小球上，然后在输液管接上微流泵以控制水流流速力的大小用斯托克斯公式F= 6rv得到，式中是粘滞系数，r为小球半径， 为水流速度。4.4. 生物膜力探针（BFP） 生物膜力探针技术是由Evans率先使用的。它由一个在张力的作用下可变形1020微米的囊泡作力传感器，张力大小的控制是通过改变膜内外的静水压力差而实现的。这个技术的优势在于力传感器的量程可以从10-15到10-9N。此方法已经被用来检

28、测配体-受体、抗原-抗体之间断键所需要的力。4.5 各种单分子微操控技术的比较 这些微操控技术包含两个基本要素：一是测力或施力装置；二是生物分子定位装置。为了实现单分子测量，必须有效地操纵单个分子。操纵方式有两种：一是接触式，如使用玻璃微针（或AFM针尖），通过与连在DNA上的小球机械接触（或直接与生物分子接触）来操纵分子；二是非接触式，通过光场或磁场控制小球间接地操纵生物分子。非接触式操纵方式测力范围较接触式小，但精度高，应用范围较广泛（图11）。（施兴华 2004）图11 微操控的例子。A. AFM实验示意图，悬臂用来作分子间力作用的传感器，悬臂的位移由激光束获得；B. 光学纤维作力传感器

29、的例子；C. 光镊的示意图；D. 磁镊示意图。图12 给DNA装上“手柄”表1 各种生物单分子实验技术的比较 方法力量程(pN)时间量程实际运用光镊0.1-15010 ms肌动蛋白、DNA、蛋白质、分子马达磁镊0.01-1001 s拉伸、扭转DNA微探针0.1100 ms拉伸、扭转、解旋DNABFP0.5-10001 ms配体-受体AFM110 sDNA、蛋白质 DNA分子的直径只有2 nm，为了在光学显微镜下有效地操纵DNA分子，必需在DNA两端装上“手柄”，其中一个“手柄”是可操控的小球或者玻璃微针。例如，在磁镊操纵系统中，用生化手段在DNA两端修饰两个不同的功能基，即链亲和素(strep

30、tavidin)和地高辛(digoxigenin)。在载玻片上修饰生物素(biotin)，可使之与DNA末端的链亲和素结合。与此相似，在微米大小的超顺磁性小球表面修饰反地高辛(antidigoxigenin)，与DNA末端的地高辛结合(图12)。在实验中，用外磁场移动磁球就达到了通过控制“手柄”来操纵DNA的目的（冉诗勇 2006）。同样，在光镊操纵系统中，将DNA携带上可供光镊移动的手柄，进而间接操纵DNA分子。5. 总结与展望细胞是生命活动的基础，而细胞又是一个由各种蛋白质机器构成的复杂系统。这一概念为物理学家用电学方法和力学方法研究生物提供了充分依据，也使对生命现象感兴趣的物理学家有了用

31、武之地。微操控技术就是物理学家试图在细胞和分子水平直接研究生命现象的典型例子。自1981年以来，膜片钳技术已经在不同动物的肝、脾、胃肠、心肌、骨骼肌、神经系统、内分泌等各类细胞上应用并取得了研究成果。膜片钳技术点燃了细胞和分子水平的生理学研究的革命之火，为从分子水平了解生物膜离子通道的门控动力学特征及通透性、选择性等膜信息，提供了最直接的手段，使人们对细胞膜通道功能的认识进入了一个崭新的阶段。膜片钳技术与其它技术结合必将继续为生命科学的发展做出巨大贡献。（田晶 2008）在单分子水平上操纵DNA是近十多年来分子生物学领域最激动人心的进展。在此基础上的DNA与蛋白质相互作用研究，为定量研究生命活

32、动中的一些基本过程奠定了基础。单分子科学正以前所未有的速度发展，实验设计理念的简单性和数据的准确性使单分子研究充满了无穷的魅力，显示了广阔的前景。在精湛的单分子实验技术保证下，可以充分发挥人们的想象去探索复杂的生命过程。（冉诗勇 2006）参考文献：1. 曹建斌. 膜片钳技术的发展及其应用. 运城学院学报 2009, 27(2):53-55.2. Neher. E and Sakmann, B. Single-channel currents recorded from membrane of denervated frog muscle fibres. Nature 1976, 260(55

33、54):799 802.3. 林燕飞, 欧阳守. 膜片钳技术研究进展及其应用. 海峡药学2008, 20(9):8-11.4. 宋孟杰. 细胞水分子探测系统放大电路的设计. 西北工业大学本科设计毕业论文 2009.5. 蒋娟, 孙惠兰, 汪萌芽. 膜片钳与单细胞RT-PCR联合研究的进展. 皖南医学院学报 2002, 21(3):224-227.6. Takashi Miki, Birgit Liss, Kohtaro Minami, Tetsuya Shiuchi, Atsunori Saraya, Yasushige Kashima, Masatsugu Horiuchi, Frances

34、 Ashcroft, Yasuhiko Minokoshi, Jochen Roeper and Susumu Seino. ATP-sensitive K+ channels in the hypothalamus are essential for the maintenance of glucose homeostasis. Nature Neuroscience 2001, 4(5):507-512.7. 刘东方, 张春光, 吴健民. 膜电容技术在检测中性粒细胞胞吐中的应用. 国外医学生理、病理科学与临床分册 2004, 24(1):108-110.8. Yang Li, Xin Ch

35、en, and Ning Gu. Computational Investigation of Interaction between Nanoparticles and Membranes: Hydrophobic/Hydrophilic Effect. J. Phys. Chem. B 2008, 112 (51):16647-16653.9. 张晓晖, 郭彦, 吴建光, 张钰, 李银妹. 光镊技术在生命科学研究中的应用. 激光与光电子学进展 2009:24-31.10. 中科大激光生物实验室网页. 11. Science Daily网站. 12. 王晓玲, 张兴华, 魏孔吉, 孙博, 李明. 一种改进型单分子操纵装置及其应用. 物理学报 2008, 57(6):3905-3910.13. 冉诗勇, 孙博, 李明. 单分子操纵与单分子生物物理. 前沿进展 2007, 36(3):228-235.14. 施兴华. 生物单分子与基底粘附的MD模拟和力学分析. 中国科学院研究生院硕士学位论文 2004.15. 田晶. 膜片钳技术的应用进展. 吉林医药学院学报 2008, 29(4):227-229.