第3章---生物物理技术-生物传感器技术.doc

1、生物传感器技术摘要：摘要生物传感器技术在医学领域中有广阔的应用前景，它具有专一、灵敏、响应快等特点，本文简要介绍了生物传感器的工作原理、分类， 探讨了各种生物传感器的研究进展及应用前景。关键词：生物传感器、原理、分类、前景目录1、引言12.生物传感器工作原理（林泉等.2007）23、发展历史和现状24.生物传感器的主要分类24.1细胞传感器 （张玉萍等.2008）24.1.1基于微电极的细胞传感器34.1.2基于半导体器件的细胞传感器34.1.3基于光纤检测的细胞传感器34.1.4基于表面等离子体共振（SPR）的细胞传感器34.1.5基于微悬臂的细胞传感器34.1.6基于石英晶体微天平（QCM

2、）的细胞传感器44.2电化学传感器（张先恩. 2006）44.2.1 酶传感器44.2.2非酶生物电极44.2.3介体生物传感器（金利通等.1995）54.2.4直接电化学酶电极（张先恩. 2006）54.2.5 DNA电化学传感器（毛斌等. 2009）64.3热生物传感器（梁振普等.2002）84.3.1 基本原理84.3.2 应用84.3.3 展望94.4压电晶体生物传感器（张波等.2004）94.4.1 压电石英晶体传感器的基本原理94.4.2压电石英晶体生物传感器的应用104.5半导体生物传感器（张宏绪.1989）124.5.1 原理：124.5.2 应用124.6 光纤生物传感器（蒲

3、晓允等.2006）134.6.1 光纤生物传感器的类型134.6.2 光纤生物传感器的应用144.6.3 展望154.7表面等离子共振传感器（孟庆石等.2009）154.7.1 仪器原理和技术参数164.7.2表面等离子共振技术在生命科学中的应用184.8丝网印刷（张贤珍等.2002）184.8.1 丝网印刷电极184.8.2 丝网印刷电化学传感器的应用194.8.3 展望224.9 分子印迹传感器（何永红等.2004）224.9.1 MIPs 的制备及其分子识别机制224.9.2 MIPs 生物传感器的研究现状234.9.3 展望254.10纳米技术传感（刘凯等.2008）264.10.1纳

4、米传感器的研究现状264.10.2安全性274.10.3应用284.10.4展望285. 生物传感器未来的发展前景28参考文献：281、引言传感器是一种可以获取并处理信息的特殊装置， 如人体的感觉器官就是一套完美的传感系统，通过眼、耳、皮肤来感知外界的光、声、温度、压力等物理信息， 通过鼻、舌感知气味和味道这样的化学刺激。生物传感器是一类特殊的传感器（李静.2007）， 通常是指由一种生物敏感部件和转化器紧密结合，对特定种类化学物质或生物活性物质具有选择性和可逆响应的分析装置。生物传感器具有选择性好、灵敏度高、分析速度快、成本低、能在复杂的体系中进行在线连续监测等特点， 特别是它高度自动化、微

5、型化与集成化的特点， 使其在近几十年获得蓬勃迅速的发展。2.生物传感器工作原理（林泉等.2007）生物传感器定义为“使用固定化的生物分子（immobilized biomolecules）结合换能器， 用来侦测生体内或生体外的环境化学物质或与之起特异性交互作用后产生响应的一种装置“。生物传感器的工作原理如图1所示：其构成包括2部分：生物敏感膜和换能器。被分析物扩散进入固定化生物敏感层，经分子识别，发生生物学反应，产生一次信号，如光、热、音等，继而被相应的物理换能器、化学换能器转变成可定量和可处理的电信号，再经过二次仪表放大并输出，以电极测定其电流值或电压值，从而换算出被测物质的量或浓度。3、发

6、展历史和现状1962年，Clark和Lyons首次把嫁接酶法和离子敏感氧电极技术结合，研制了测定葡萄糖含量的酶电极，开创了生物传感器的先河。5年后，Updike和Hicks制成了固定化酶电极这是生物传感器的首次问世。20世纪70年代，相继出现了电流型和电位型微生物电极、组织电极、线粒体电极。20世纪80年代，利用生物反应中的光效应、热效应、场效应和质量变化而开发的生物传感器蓬勃发展，开始了生物电子学传感器的新时代。到目前为止，生物传感器大致经历了3个发展阶段：第一代生物传感器是由固定了生物成分的非活性基质膜（透析膜或反应膜）和电化学电极所组成；第二代生物传感器是将生物成分直接吸附或共价结合到转

7、换器的表面，而无需非活性的基质膜，测定时不必向样品中加入其它试剂；第三代生物传感器是把生物成分直接固定在电子元件上，它们可以直接感知和放大界面物质的变化，从而把生物信号的识别和转换结合在一起。4.生物传感器的主要分类生物传感器的基本分类方法有两种： 按生物敏感材料分类法和按能量（ 或信号） 分类法。按生物敏感材料分类， 可分为： 酶传感器、免疫传感器、微生物传感器、细胞传感器、光生物传感器、组织传感器等； 按转换器件分类， 可分为： 化学生物传感器、热生物传感器、光生物传感器、半导体生物传感器和声生物传感器等。本文主要介绍细胞传感器、电化学传感器、热生物传感器、压电晶体生物传感器、半导体生物传

8、感器、光纤生物传感器、表面等离子共振生物传感器、丝网印刷生物传感器、分子印迹生物传感器、纳米生物传感器。 4.1细胞传感器 （张玉萍等.2008）细胞传感器是由固定或未固定的活细胞与电极或其他转换器组合而成的一类生物传感器。当活细胞与分子识别元件特异性结合后，产生的信息通过换能器转换为可定量和可处理的信号，从而达到分析检测的目的。细胞传感器已成为生物传感器研究领域的一大热点。本文对细胞传感器进行了分类；综述了细胞传感器的研究方法、应用领域和研究进展，并对细胞传感器的未来发展方向做出展望。4.1.1基于微电极的细胞传感器近年来，微电极因其独特的优越性能而在纳米生物传感器、单细胞分析、电化学动力学

9、研究等众多领域显示出了巨大的潜在应用性。微电极既可以置于细胞周围环境又可以插入细胞内部，所以，利用微电极可实时定量地监测单个细胞内外的电活性物质及其变化。1976年，Neher和Sakamann利用微玻管电极首先建立了膜片钳技术，即采用微玻管电极接触细胞膜，以千兆欧姆以上的阻抗使之封接，使与电极尖开口处相接的细胞膜片与其周围在电学上分隔，在此基础上固定电位，从而检测记录此膜片上的离子通道的离子电流。膜片钳技术已成为细胞内测量的一种常规手段，它可以测量多种膜通道电流（其值可小到0.06 pA），具有0.01ms时间分辨力。但膜片钳技术的缺点是细胞的封接较困难，不适宜长期测量，且在实时检测细胞胞吐

10、释放方面缺乏特异性。4.1.2基于半导体器件的细胞传感器将单个细胞或某些细胞体系固定到一个裸露（无金属栅）的场效应管（FET）上便构成了FET细胞传感器。这种细胞传感器对细胞的监测可分为两大类：一是测定细胞本身的能量代谢与呼吸等引起的变化； 二是测定一些细胞（如，神经细胞、肌肉细胞）和某些细胞网络在受到某些刺激时产生的电位变化。Meyburg S等人研制了一种可记录细胞外电信号的带有悬浮栅的FET， 这种FET将一个CMOS型n沟道晶体管与一个独立敏感区域链接起来，相对非金属栅极的FET而言，它的噪声系数比较小。他们以小鼠胚胎心脏肌细胞为研究对象，用此FET分别记录了药物作用于心脏前后的细胞外

11、电信号。FET具有很多优点，如，可放大微弱信号、可无损测量等。因此， FET细胞传感器研究将是一个非常有意义的方向。4.1.3基于光纤检测的细胞传感器光纤生物传感器主要由光纤和生物敏感膜组成，通过检测生物反应所产生的光的强度、振幅、相位等参数确定被检物质的量。它的应用越来越广泛，已用于医学病原体、食物毒性、生化武器和环境样品等的快速检测。Maraldo D等人在锥形光纤表面固定聚赖氨酸和大肠杆菌（E.Coli）（JM101）表达绿色荧光蛋白（GFP），480 nm的光进入光纤，通过测定倏逝场的变化测得了E.Coli（JM101） 表达GFP的生长率。Dinh研究组在光纤纳米生物传感器方面作了大

12、量的研究，如2004年，Dinh等人发展了一种结合有抗细胞色素c的抗体的光纤纳米免疫传感器，他们将该传感器与酶联免疫分析结合，成功地监测了MCF - 7细胞中细胞色素c的释放。优缺点：光纤纳米生物传感器具有体积微小、灵敏度高、抗干扰性强、不需要参比器件等优点，在单细胞内结构、物质的在体测量等方面具有潜在的应用价值。4.1.4基于表面等离子体共振（SPR）的细胞传感器SPR是等离子体物理学和量子场论中的一个概念，它是电磁波所激励的在金属和电介质交界面上形成的影响电磁波传播的谐振波。SPR生物传感器是SPR与生物分子特异性相互作用分析原理相结合的产物，它主要包括光波导器件、金属薄膜、生物分子膜3

13、个组成部分。Ravik M 等人以SPR原理为基础获得了微生物细胞表面指纹图谱。他们以4种不同的E.Coli突变体为研究对象，当细胞悬浮液流过4种具有不同物理和化学性质的表面时，通过记录细胞与突变体表面的相互作用即可获得细胞表面的指纹图谱。SPR生物传感器的检测过程方便快捷、抗电磁干扰能力强，已经成为一种成熟的检测生物分子间相互作用的方法和手段。4.1.5基于微悬臂的细胞传感器微悬臂是一种结构简单的传感器结构，少量的分子吸附在微悬臂梁的表面就会导致悬臂梁弯曲偏转量和谐振频率的变化。AntonikM D等人蚀刻了200mm 30mm 0. 6mm （长度宽度厚度）的微悬臂，并在该微悬臂的一侧溅射

14、具有良好反射特性的金薄膜，另一侧沉积Si3N4 ，然后，将MDCK细胞培养在沉积有Si3N4 的一侧。细胞在不同毒素的刺激下运动会引起悬臂梁发生不同程度的偏转，将激光束照射在悬臂梁溅射有金薄膜的一侧，利用对位置敏感的光电二极管接收反射光，即可在纳米量级检测到这种偏转。实验表明：可将这种集成细胞的悬臂梁用于实时监测活细胞的力学性能。Satoshi等人利用类似方法将少量细胞吸附在微悬臂梁的一侧，初步得到了细胞浓度与微悬臂梁共振频率之间的关系。Burg T P等人蚀刻了长为200m，宽为33m，厚为7m的微悬臂，他们在该微悬臂上构建了高为3m，宽为8m微流通道，当待测样品（如，生物分子、单细胞、纳米

15、颗粒等）随着流体流过微流通道时，微悬臂的质量增加，从而导致其共振频率发生变化，通过测得此频率的变化，他们测得了几种生物分子、细胞、纳米颗粒的质量。4.1.6基于石英晶体微天平（QCM）的细胞传感器QCM系统主要由电子振荡电路、频率计数器和压电石英晶体3部分组成，当石英晶体表面质量变化时将引起压电晶片振动频率的改变。根据这一原理， Fohlerova Z等人将老鼠上皮细胞（WBF344） 和肺黑素瘤细胞（B16F10）黏附在传感器的金表面，通过测定压电谐振器频率与电阻的变化，用QCM实时检测了细胞黏附性。结果表明：这类压电传感器适合用于研究细胞黏附过程，并为识别和筛选对细胞形状、黏附有影响的生物

16、活性药物及其他生物大分子提供了具有应用前景的监测工具。4.2电化学传感器（张先恩. 2006）电化学生物传感器主要由生物分子识别和信息转换部件两部分组合构成。其设计原理是待测物通过生物分子识别部件将被感知物质的非电信号转换成可测量的电信息，再经过放大信号处理，进行信号输出（图1）。其中识别器件主要用来感知样品中是否含有待测物质，转换器件则将识别器件感知的信号转化为可以观察记录的信号（如电流大小、频率变化、荧光和光吸收的强度等）。在待测物、识别器件以及转化器件之间由一些生物、化学、生化作用或物理作用过程彼此联系。当待测物与分子识别元件特异性结合后，所产生的复合物（或光、热等）通过信号转换器变为可

17、以输出的申 信号、光信号等从而 到分析柃测的目的.主要分为酶传感器，非酶传感器，介体生物传感器，直接电化学生物传感器和DNA电化学生物传感器。4.2.1 酶传感器酶传感器主要由固定化酶膜和变换器组成： 固定化酶膜可以选择性地”识别”被检测的物质， 并且催化被”识别”出的物质发生化学反应； 变换器则把这一催化反应中底物或产物的变量转换成电信号， 进而通过仪表显示出来。酶传感器一般由固定化酶和电化学装置（电极）组合构建而成，所以又称为酶电极（enzyme electrode）。将葡萄糖氧化酶固定在能透过葡萄糖和氧的薄膜上， 然后固定在氧电极的前端。当溶液中存在着葡萄糖时， 葡萄糖在通过固定化酶膜时

18、被葡萄糖氧化酶氧化。反应时需消耗氧气， 而这种消耗量可用氧电极测定到。由于固定化葡萄糖氧化酶的稳定性极高， 一张固定化酶膜可以使用一年以上， 所以检测费用很低。4.2.2非酶生物电极包括：微生物电极、免疫电极、生物亲和电极、组织电极、杂合生物电极4.2.2.1 微生物电极传感器将微生物（ 常用的主要是细菌和酵母菌） 作为敏感材料固定在电极表面构成的电化学生物传感器称为微生物电极传感器。其工作原理大致可分为3 种类型：（1）利用微生物体内含有的酶（单一酶或复合酶） 系来识别分子， 这种类型与酶电极类似；（2）利用微生物对有机物的同化作用，通过检测其呼吸活性（ 摄氧量）的提高，即通过氧电极测量体系

19、中氧的减少间接测定有机物的浓度；（3）通过测定电极敏感的代谢产物间接测定一些能被厌氧微生物所同化的有机物。微生物电极传感器在发酵工业、食品检验、医疗卫生等领域都有应用。例如； 在食品发酵过程中测定葡萄糖的佛鲁奥森假单胞菌电极； 测定甲烷的鞭毛甲基单胞菌电极； 测定抗生素头孢菌素Citrobacterfreudii 菌电极等等。微生物电极传感器由于价廉、使用寿命长而具有很好的应用前景， 然而它的选择性和长期稳定性等还有待进一步提高。4.2.2.2免疫传感器免疫传感器是依赖抗原和抗体之间特异性和亲和性， 利用抗体检测抗原或利用抗原检出抗体的传感器。并非所有的化合物都有免疫原性，一般分子量大、组成复

20、杂、异物性强的分子。但免疫传感器更适合于研制能连续、重复使用的毒剂监测器材。免疫分析法选择性好，如一种抗体只能识别一种毒剂，可以区分性质相似的同系物、同分异构体，甚至立体异构体，且抗体比酶具有更好的特异性，抗体-抗原的复合体相对稳定，不易分解。4.2.2.3生物亲和电极生物亲和电极是基于两种物质对某种物质的亲和性不同而设计的传感器。由Ikariyama等将4-羟偶氮苯甲酸（HABA）固定在氧电极上，用过氧化氢酶标记抗生物素蛋白，抗生物素蛋白再与HABA结合，挂在氧电极表面.由于生物素对抗生物素有更高的亲和力，当样品中含有生物素时，生物素取代HABA与抗生物素结合，使抗生物素游离下来，从而减少了

21、氧电极表面的酶量。洗去反应液，加入H2O2，经过电极输出电流强度可以知道还有多少酶存在，由此推算出样品中生物素浓度。4.2.2.4组织电极（组织传感器）直接采用动植物组织薄片作为敏感元件的电化学传感器称组织电极传感器， 其原理是利用动植物组织中的酶， 优点是酶活性及其稳定性均比离析酶高， 材料易于获取， 制备简单， 使用寿命长等。但在选择性、灵敏度、响应时间等方面还存在不足。动物组织电极主要有：肾组织电极、肝组织电极、肠组织电极、肌肉组织电极、胸腺组织电极等。植物组织电极敏感元件的选材范围很广， 包括不同植物的根、茎、叶、花、果等。植物组织电极制备比动物组织电极更简单，成本更低并易于保存。4.

22、2.2.5杂合生物电极杂合生物电极是分子识别元件中含两种或两种以上不同源的生物活性材料，能测定某一特定底物的电极。4.2.3介体生物传感器（金利通等.1995）前述的电流型生物电极多以分子氧作为生物氧化还原反应的电子受体，在环境缺氧或者环境氧分压不断变化的时候，测定显然会遇到麻烦，如果用某种物质取代O2、H2O2，在酶反应和电极之间进行电子传递，便能够避免上述问题，这种物质就是化学介体，利用这种原理构成的传感器便称为介体生物传感器。这种传感器利用一些氧化还原介质在酶和电极之间进行电子转移， 不但可以较好地解决上述问题， 而且能降低工作电位， 缩短响应时间， 提高酶电极的选择性和重现性。但目前研

23、究的此类酶电极都存在着介体容易流失、一些还原性较强的如抗坏血酸、尿酸等的干扰和电极污染等不足。金利通等人采用羧酸二茂铁碳糊修饰电极为基体电极，在此电极上固定葡萄糖氧化酶，并敷一层浸有Nafion的尼龙网制成葡萄糖化学修饰电极传感器。该传感器采用羧酸二茂铁作为葡萄糖氧化酶与电极之间的电子传递体，不仅具有介体型传感器的优点， 而且能克服此类传感器的不足。利用碳糊的憎水性能防止介体流失到溶液中去， 一层浸有Nafion的尼龙网既防止酶层脱落、介体流失， 又能减少电极污染， 提高抗干扰能力， 为介体修饰葡萄糖生物传感器的研制提供了一种新方法。4.2.4直接电化学酶电极（张先恩. 2006）电化学生物传

24、感器可分为三代：第一代为经典的电化学生物传感器，以酶电极作为代表；第二代为介体酶传感器，解决了对氧的依赖和电极活性物质的干扰问题；第三代为直接电化学酶电极，主要解决酶等生物识别元件与电极之间的低效率通讯问题。与经典酶电极和介体酶电极相比，直接电化学酶电极既不需要氧分子，也不需要化学介体分子作为电子传递体，通常还不需要固定化载体，而是将酶分子直接吸附固定到电极表面，使酶的氧化还原活性中心与电极直接”交流”，能够更快地进行电子传递，从而使酶电极的响应速度更快、灵敏度更高，成为真正”无试剂分析”。进行直接电化学反应的酶类和蛋白质类：化还原酶类，红蛋白、肌球蛋白。4.2.5 DNA电化学传感器（毛斌等

25、. 2009）4.2.5.1 原理DNA电化学传感器是由一个支持DNA片段（即DNA探针）的电极（包括金电极、玻碳电极、热解石墨电极和碳糊电极等）和电活性杂交指示剂构成。DNA探针一般是由2040个碱基组成的核苷酸片段，包括天然的核苷酸片段和人工合成的寡聚核苷酸片段。将ss-DNA修饰到电极表面，构成DNA修饰电极，由于电极上的探针DNA与溶液中的互补链（即靶序列）杂交的高度序列选择性，使得DNA修饰电极具有极强的分子识别能力。DNA探针分子与靶序列杂交，在电极表面形成ds-DNA，从而导致杂交前后电极表面DNA结构的改变，这种杂交前后的差异可用杂交指示剂来识别，从而达到检测的目的。DNA电化

26、学传感器具有快速、灵敏和价廉等优点，是目前DNA传感器中最成熟的一种，其工作原理如图所示。4.2.5.2 DNA电化学生物传感器的应用现状将DNA电化学生物传感器在各个领域的研究进展简要介绍如下：4.2.5.2.1 在医学上的应用4.2.5.2.1.1 细菌及病毒感染类疾病诊断在传统方法中，细菌及病毒感染类疾病是通过血液体外培养来诊断的，这需要几天甚至几十天的时间严重延误了疾病诊疗。利用DNA电化学生物传感器可快速检测细菌和病毒，Hashimoto等利用光刻微细加工技术刻蚀出03 mm的固定DNA探针微金膜电极，应用于测定乙型肝炎病毒。4.2.5.2.1.2 基因诊断Millan等 用ssDN

27、A修饰了碳糊电极，用该传感器测定了l8个碱基长度的囊性纤维变性基因序列。Wang等 对肿瘤抑制基因p53进行检测。取得满意的结果。Wang等提出以肽核酸（PNA）代替ssDNA作为探针修饰到电极表面，已证明PNA与互补核苷酸的杂交特性在很多方面显示出优于ssDNA的性能，有望被很好地用于基因诊断。4.2.5.2.1.3 DNA损伤研究DNA损伤物质的监测属于早期诊断和预防重大疾病的重要步骤之一。孙星炎等以石墨电极为基底电极，研究了在不同致突变因素（包括紫外光照射、亚硝酸）的作用后，特定碱基序列的DNA与电极表面的ssDNA能否杂交及杂交程度以此来探讨DNA突变情况及可能的突变机理。Wang等直

28、接固定dsDNA，制备出微型电化学传感器，通过探讨紫外光辐射引起的DNA中鸟嘌呤氧化峰信号的变化，检测DNA的损伤。4.2.5.2.1. 4 药物检验DNA传感器在药物分析中的应用也越来越受到关注。Brett等利用DNA修饰电极建立了对抗癌药卡铂的测定方法：Ovfidekovfi等人利用DNA修饰电极研究了黄连素对癌细胞基因的作用：Kerman等人 建立了一种新型的杂交检测方法有望用于制药和临床诊断；Gu等人研究了一种新型的碳糊电极可检测抗早孕药物米非司酮。4.2.5.2.2 在环境监测中的应用4.2.5.2.2.1 环境有机物的监测Wang等报道了测定肼类化合物的电化学DNA传感器，能灵敏测

29、定水中的不同肼类化合物检测限为1 10 gmL。还研究了用于芳香胺类化合物测定的DNA传感器，对芳香胺类化合物的检测限可达到纳摩尔数量级。Brett等人研究了DNA电化学生物传感器，可检测三嗪衍生物引起的环境污染物。4.2.5.2.2.2 环境病原微生物的监测大肠杆菌（Ecoli）是一种致病菌，常会引起腹泻等疾病Wang等利用丝网印刷转换器，研制了测定环境中Ecoli DNA序列的电化学生物传感器。4.2.5.2.2.3 重金属离子的监测DNA和重金属离子相互作用机理，是研究重金属对DNA产生毒效作用的关键。也是近年来活跃的前沿研究领域之一。干宁等人利用DNA电化学生物传感器测定水中痕量铅，检

30、测限为20 10-8molL。4.2.5.2.3 食品工业4.2.5.2.3.1 转基因食品的检测杜晓燕等将生物素标记的ssDNA通过生物素一亲和素体系固载到铂电极上识别转基因食品中的特异DNA序列该方法检测灵敏度高。4.2.5.2.3.2 食品新鲜程度的检测文献报道上海科学家研制出新型DNA电化学生物传感器。能灵敏地检测细胞中的能量分子三磷酸腺苷（ATP）的含量。人工合成的DNA只要碰上ATP，双螺旋结构就会解链。导电性增强，因此只要测出电流的大小，就能知道ATP的含量。该传感器可用于快捷地检测食品的新鲜程度。4.2.5.2.4 基因芯片基因芯片是将分子生物学技术与半导体工业的微型制造技术结

31、合，把巨大数量的寡核苷酸、肽核酸或DNA分子固定在一块面积极小的基片（如：硅片、玻片或尼龙膜等）上构成。经典的芯片检测一般采用同位素或荧光染料为信号报告分子，但都存在一定的缺点，如：灵敏度低、特异性不高、操作复杂、耗时长、有污染、需避光、半衰期短、易淬灭及不易检测等。从而长期制约着基因芯片的更为广泛地应用和发展 。因此寻求一种更安全、更方便简单、更灵敏特异的信号分子或检测手段是芯片技术研究的难点和热点。DNA电化学生物传感器技术具有诸多优点。其研究对完善DNA芯片技术是有益尝试。Devaraj等人设计了一种简易而直接的固定寡核苷酸表面阵列的方法，他们将带有乙烯基的寡核苷酸与金电极表面叠氦功能化

32、的自组装单分子层作用得到高度有序、选择性好的DNA阵列。除了上述领域，DNA电化学传感器的研究应用范围还在不断拓宽，例如蒋晓华等人 研究了DNA一过氧化聚吡咯生物复合膜传感器。可用于检测神经递质。4.2.5.3展望电化学DNA传感器的研究工作开辟了电化学与分子生物学的新领域。为生命科学的研究提供了一种全新的方法，在遗传疾病诊断、病原微生物检测、转基因生物检测等方面显示了广泛的应用前景。目前，尤其在国内还处于起步阶段。电化学DNA生物传感器的研究将主要集中在以下几个方面：1）优化电极结构及ssDNA的固定技术，例如发展自组装修饰技术等，提高ssDNA的固定效果；2）结合其它技术如纳米技术等，获得

33、更高灵敏度的检测；3）继续深人研究其在临床基因诊断、药物筛选等方面的应用；4）寻求其它技术与DNA电化学生物传感器的结合拓展其研究应用领域；5）应用肽核酸（peptide nucleic acid，PNA）取代ssDNA，以提高传感器的稳定性；6）实现人工智能化、微型化、商品化，使此类传感器渗透到人们的生活实践中。4.3热生物传感器（梁振普等.2002）生物体是由无机的和有机的分子组成的，这些分子在相互反应的同时也伴随着能量的交换，其中热能的交换是最为常见的形式之一。因此量热分析方法在生物测量中具有广泛的适用性。 虽然有些反应几乎不产生热，如用胆碱酯酶水解乙酰胆碱，其焓变接近于零，但是这个反应

34、仍可以用量热的方法进行检测，例如通过水解步骤产生质子，此质子能使质子化焓变大的缓冲液质子化，因而使总的过程成为放热的反应。热生物传感器（calorimet ric biosensor） 的研究历史相当久远，其发展过程可以大概分为如下5 个历史阶段：简单分析系统、经典分析系统、小型分析系统、微型分析系统和杂合分析系统。近年来研制出的热生物传感器多采用了固定化酶（immobilized enzyme） 技术和微加工技术。这种方法将量热的广泛适用性、酶学反应的专一性以及微器件的特殊优点结合了起来，因而成为这类传感器的主流，与其它分析方法相比较，量热分析方法具有其独特的优点：适用于大多数生物样品的分析

35、； 不受光、电化学物质等干扰因素的影响；引入参比部件，外界对测量结果的影响很小；固定化酶部分可以更换，器件可以重复使用； 便于采用流动注射技术（flow injected technology） ，操作简单。 随着各种性能优越的新型量热器件的问世，近年来热生物传感器正越来越广泛的应用于临床医学、环境监测、食品卫生、工业过程监测等方面。4.3.1 基本原理此类生物传感器的核心部分是酶柱（ enzyme column） ，通常采用固定化酶的形式。固定化酶通常被填充在热绝缘性好的有机材料或金属做成的柱子内，产生的热通过热的良导体，如，金属管，导出反应柱，并通过固定在金属管外的热传感器测量其温度变化。

36、一个酶柱通常使用两个热敏元件，一个在出口处，测量反应后的酶柱温度；一个在入口处，为出口处的温度值提供一个参比温度值。热生物传感器是根据生化反应产生的热量的多少对待测物质进行定量的。如果反应体系是绝热体系，则反应产生的热会使酶体系温度升高，通过测量体系的温度变化便可推知待测物的含量。 若生化反应放出的热量全部用于反应体系的温度升高，则满足下列关系式： T = - nH/ CS。式中n 为产物的摩尔数；H 为生化反应的焓变；T为反应体系温度的变化； CS 为反应体系的热容量。由此式可见温度变化与底物浓度呈线性关系。当样品溶液通过蠕动泵进入反应器时，由于生化反应放热，便会产生温度峰。正常情况下峰高或

37、面积可以作为待测物浓度的量度。 但是，在实际的测量系统中，酶柱出口和入口处的温度差要小于绝热体系的温度变化。这是因为装置中所采用的流动注射系统损失了一部分热量。为了精确地检测反应中微小的温度变化，必须减少热量的损失，降低酶柱的热容量，提高热敏元件与酶柱的热交换效率。4.3.2 应用经过几十年的发展，热生物传感器已经是生物分析领域的主角之一。特别是近二十几年来，随着技术的不断进步，工艺的逐步改进，这类传感器的性能越来越优越，它在工业过程监测、医疗卫生、食品、环境等方面的应用也越来越多。4.3.2.1 临床应用这类生物传感器在临床上常常用于检测代谢物的浓度。比如，人类血液中的代谢物与人的健康状态密

38、切相关，所以在医学上，检测病人的血液情况是非常必要的。被检测的代谢物常常是乳酸、尿素、葡萄糖等。用固定化尿酶测定血清中的尿素的方法已有几例报道。Danielsson 等曾报道了一种线性范围较宽的方法。由于该方法是将血清样品稀释10 倍后测定的，对多数样品浓度均可降0. 310 mmol/ L范围，这样对酶的失活可起到显著的限制作用，所以酶柱工作的稳定性高。每个样品测定时间为23min ，相对标准差为1 % ，这种酶柱已用于临床，一个酶柱可用数月或几百次。检测常用的方法有：离体检测、在线检测、多底物同时检测、杂合型检测等。4.3.2.2 工业过程控制和发酵分析热生物分析器件最有希望的应用领域之一

39、是过程控制和发酵分析。 随着生物技术的发展，可以预料在线测定反应过程中形成的或消耗的特定成分的方法将愈来愈引人注目。在发酵过程中很需要对原料和中间产物以及生成物质等的浓度连续测定用以控制过程的进行。在这一方面，酶热敏电阻最为适用。用酶热敏电阻对糖、青霉素等的监测和控制已有报道。4.3.2.3 酶活检测热传感器在酶活测定方面的优势已经引起分析生物学和分子生物学界的广泛重视。例如，固定化脂蛋白酶与磷酸三丁脂和环己胺的反应活性可以用酶热敏电阻做比较.可以检测出山葵过氧化物酶在甲苯中放出比水中高的多的热信号。Danielsson等人发现温度响应与酶活之间存在线形关系，约在0. 010. 1 U/ mL

40、 范围。用量热法测定酶的活性对临床诊断，酶纯化过程的监测都是很有用的。虽然这种方法灵敏度低，但具有使用廉价的底物和样品不必处理的优点。4.3.2.4 环境监测热型生物传感器也可以用于连续或不连续的环境监测，后者起着对毒物的报警作用。有两种测定方法：一种是以对生物活性物质的活性抑制为基础的测定方法，生物活性物质的活性受到抑制后，其焓变减小，即焓变随抑制物浓度的增加而减小，曾利用Hg2+ 对尿酶的活性的抑制作用，用尿酶热敏电阻对Hg2+进行测定，可得到0. 2g/ L ；另一种是以污染物作为酶的底物而进行测定的方法，用硫氰酸酶热敏电阻测定氰化物就是利用这种方法的测定实例。测定有毒物质也可采用完整细

41、胞、细胞器或多酶体系。4.3.3 展望面对热生物传感器具有的种种优点，有越来越多的分析生物学家正表现出极大的兴趣。可以说在过去的几十年里，热生物传感器已经取得了相当辉煌的成就，但是不得不承认对它的认识还很浅薄。可以预料的是，随着科学技术的发展，量热传感器在理论及设计方面将越来越合理；随着人类生活水平的提高，小型及微型热生物传感器将是量热分析领域的最为活跃元素。目前，人类正处在令人振奋的信息时代，在这个时代里不但有先进的电子计算机和电信网络，而且基因组学和蛋白质组学将提供大量的前所未有的人类奥秘。不难想象，这两大技术革命将成为新一代量热传感器的两条腿，推动它向一个全新的境界阔步迈进。早在微型器件

42、诞生之初，国际上有远见的分析科学家已经提出了将之与计算机相结合的想法。其实，这种量热器件不仅可以作为未来计算机的一个附带器件，还可以安装在移动电话上面1这类新型传感器有其”先人”所望尘末及的优点：可以利用计算机方便快捷的处理实验结果、实现了傻瓜操作、通过网络可以方便的收发信息实现远程医疗。只要持有这种传感器，不论人在什么地方患了疾病，只要取几微升的体液加入反应室，按几个键，便可以获得有关疾病的信息，还可以通过电信网络将实验结果发给私人医生，以获得医疗建议或处方。虽然目前还没有成熟的此类产品面世，但是可以相信这类传感器件将会在未来的分析舞台上大放异彩。4.4压电晶体生物传感器（张波等.2004）

43、压电石英谐振测量技术是20 世纪60 年代建立起来的一种新型测量技术。在20 世纪80 年代压电石英晶体在液相稳定振荡获得成功后， 压电石英谐振测量技术才开始广泛应用于生物传感器领域。压电石英谐振测量技术对晶体表面（电极表面） 质量负载的变化和石英晶体所处体系的性状如溶液的密度、粘度、电导率、介电常数等的变化非常敏感， 具有ng 级的质量检测灵敏度， 能够敏感地测量微观反应过程中的微小变化并转化为可以定量检测的频率信号， 为获取反应体系丰富的实时在线信息提供了一种简单、快捷的可靠手段。因此， 近年来压电石英晶体传感器发展迅速， 出现了许多种类、不同类型的压电石英晶体生物传感器， 已广泛应用于医

44、学诊断、环境监测、食品卫生检验以及工业生产等领域， 受到生物学家和工程学家的高度重视， 成为生物传感器领域研究的热点之一。4.4.1 压电石英晶体传感器的基本原理压电石英晶体传感器是利用石英晶体作为基底的体声波器件在厚度剪切模式振荡过程中与周边环境的相互作用， 由器件超高频声波的声电阻抗谱、频谱或相位等参量变化对环境介质如质量、粘弹性、导纳、介电或流变特性等物理化学性能作出相关应答并转换成相应的检测信号。4.4.2压电石英晶体生物传感器的应用4.4.2.1在医学实验诊断方面的应用4.4.2.1.1压电石英晶体免疫传感器它是利用石英晶体微天平对表面质量负载的高度敏感性和抗体特别是单克隆抗体与其相

45、应抗原之间的特异识别功能相结合的生物传感器。应用中一般采用固定抗体来检测抗原， 应用较多的是单克隆抗体。单克隆抗体是针对抗原某一决定簇的抗体， 只与其相应的抗原决定簇结合， 有效地避免了抗原抗体交叉反应的出现，赋予了压电石英晶体免疫传感器对检测物质的特异识别并结合的基础。近年来， 压电石英晶体免疫传感器应用于医学实验诊断的报道很多。4.4.2.1.1.1 用于致病微生物如细菌、病毒、衣原体等的检测准确、快速的细菌检测具有重要的临床应用价值。Carter 等利用基频10MHz 的压电免疫传感器快速检测O 139 血清型霍乱弧菌， 最低检测限是105 个/ml。Park 等利用Sulfosucci

46、nim idyl62 3-（2-pyridyldith io ） propionamido hexanoate （Sulfo2LC2SPDP） 自组装技术把巯基化的沙门氏菌抗体固定在10MHz 压电石英晶体表面， 提高了检测的灵敏度、特异性以及重复使用次数。Ben 等研制了一种检测尿液中沙眼衣原体的石英晶体免疫传感器，他们同样利用生物自组装技术在石英晶体电极表面制备抗体敏感膜。检测尿液标本的线性范围为260ng/ml 7. 8g/ml。病毒的体外培养相对比较困难， 快速诊断方法少。目前病毒的临床实验诊断开展尚不多。压电免疫传感器的出现为病毒的快速诊断提供了一种新的手段。有人将H IV 某抗原表

47、位的人工合成肽固定于石英晶体电极表面， 检测体液标本中的H IV 抗体；也有学者先采用人工合成单纯疱疹病毒、 型、带状疱疹病毒、巨细胞病毒、EB 病毒、人疱疹病毒26型等人疱疹病毒的各自特异抗原肽， 制备相应的单克隆抗体， 单克隆抗体通过蛋白A 固定在10MHz的压电石英晶体金电极表面制成免疫敏感膜， 检测样品中的病毒颗粒。结果显示免疫传感器的稳定性好， 该方法的线性检测范围为5104 1109 个病毒/英晶体表面， 在室温可保存8 周， 传感器经再生后可重复使用18 次。国内吴朝阳等研制了检测日本血吸虫的石英晶体免疫传感器， 该传感器能较好地定量区别血吸虫感染程度。4.4.2.1.1.2 体

48、液蛋白质的定性与定量检测利用压电石英晶体免疫传感器检测蛋白质研究最多的是定量检测人免疫球蛋白如IgA 、IgG、IgM、IgE 等。这类压电石英晶体免疫传感器的基本原理相似， 用各种免疫球蛋白的抗体固定在石英晶体金电极表面制成免疫识别敏感膜。Su 等用压电石英晶体免疫传感器检测IgE， 传感器的检测范围为5 300 IU/m l。传感器用尿素和甘氨酸再生后可重复使用5 次， 其灵敏度和特异性无明显下降。叶为全等利用412MHz 的金膜压电石英晶体， 把抗体通过2氨基丙基三乙氧基硅烷（-amino propyl tri ethoxy sillane APTES） 固定在晶体金膜表面， 检测人血清中IgG的含量。有人用鱼精蛋白作为分子识别元件制作了检测IgM 的免疫传感器， 其检测范围为593g/ml，检测结果与免疫扩散法一致。目前用压电石英晶体免疫传感器检测激素、尿液中蛋白质也有报道。有人把胰岛素的特异性抗体固定在晶体电极表面， 检测血液中胰岛素的浓度。这种免疫传感器的最低检测限为1g/m l