动物细胞工程1.ppt

1、克隆（clone）：亦称无性繁殖系或简称无性系。历史上的史上的78年年7月月26日：第一个日：第一个试管管婴儿儿诞生生复习回顾：植物细胞工程采用的技术复习回顾：植物细胞工程采用的技术手段有哪些？其理论基础是什么？手段有哪些？其理论基础是什么？所采用技术的理论基础植物细胞工程通常采用的技 术 手 段植物组织培养植物组织培养 植物体细胞杂交植物体细胞杂交植物细胞全能性植物细胞全能性动物细胞工程通常采用的技 术 手 段动物细胞培养动物细胞培养动物细胞融合动物细胞融合单克隆单克隆抗体抗体核核移植移植是其他动物细胞工程技术的基础。是其他动物细胞工程技术的基础。幼龄动物幼龄动物剪碎组织剪碎组织胰胰蛋蛋白白

2、酶酶处处理理细胞培养细胞培养一、动物细胞培养一、动物细胞培养一、动物细胞培养从从年龄看，材年龄看，材料动物有何特料动物有何特点，为什么？点，为什么？要将组织分散要将组织分散成单个细胞，成单个细胞，可怎样处理？可怎样处理？此处细胞在此处细胞在该生活环境中该生活环境中能无限生长和能无限生长和增殖吗？增殖吗？一般为一般为幼龄幼龄动动物或物或胚胎胚胎，分，分裂次数多。裂次数多。可用可用胰蛋白酶胰蛋白酶处理使之分散处理使之分散成单个细胞。成单个细胞。不能不能。需要定。需要定期转移、分装期转移、分装培养。培养。一、动物细胞培养一、动物细胞培养动物胚胎或幼龄动动物胚胎或幼龄动物的组织、器官物的组织、器官细胞

3、悬浮液细胞悬浮液胰蛋白酶胰蛋白酶10代细胞代细胞原代培养原代培养40-50代细胞代细胞传代培养传代培养细胞株细胞株无限传代无限传代细胞系细胞系单个细胞单个细胞加加培养液培养液动物组织细胞间隙动物组织细胞间隙中含有一定量的弹中含有一定量的弹性纤维等蛋白质，性纤维等蛋白质，将细胞网络起来形将细胞网络起来形成具有一定弹性和成具有一定弹性和韧性的组织和器官。韧性的组织和器官。原代培养原代培养(primary culture)定义：定义：把第把第1 1代细胞的培养与传代细胞的培养与传1010代以内的细代以内的细胞培养统称为原代培养。胞培养统称为原代培养。过程：从动物机体中取出组织从动物机体中取出组织 剪

4、碎剪碎 加胰蛋白酶加胰蛋白酶 细胞游离细胞游离 加培养液加培养液 将将细胞细胞接种到培养瓶内接种到培养瓶内 培养（培养（1212天换一次天换一次培养液）培养液）细胞贴壁生长细胞贴壁生长 长成单层细胞长成单层细胞细胞贴壁过程传代培养传代培养(subculture)定义：当原代培养的细胞生长停止，这当原代培养的细胞生长停止，这时如果要使细胞继续生长，就要及时用时如果要使细胞继续生长，就要及时用胰蛋白酶等胰蛋白酶等，使细胞从瓶壁上解离下来，使细胞从瓶壁上解离下来，然后加入新的培养液，将然后加入新的培养液，将细胞分离稀释，细胞分离稀释，并从原培养瓶内转接到新的培养瓶内，并从原培养瓶内转接到新的培养瓶内

5、，这个过程称传代培养这个过程称传代培养 细胞株：细胞株：从原代培养细胞群中筛选出进行传从原代培养细胞群中筛选出进行传代培养的细胞，能传到代培养的细胞，能传到40-50代，其遗代，其遗传物质没有发生变化。传物质没有发生变化。细胞系：细胞系：传到传到40-50代后有部分细胞遗传物代后有部分细胞遗传物质发生了变化，带有癌变的特点，可能在质发生了变化，带有癌变的特点，可能在培养条件下无限制的传代下去，这种传代培养条件下无限制的传代下去，这种传代细胞称为细胞系。细胞称为细胞系。思考：思考：1、动物细胞培养液的主要成分是什么？较植物动物细胞培养液的主要成分是什么？较植物组培培养基有何独特之处？组培培养基有

6、何独特之处？主要成分：葡萄糖、氨基酸、无机盐、维生素和动物血清等。主要成分：葡萄糖、氨基酸、无机盐、维生素和动物血清等。独特之处有：独特之处有：1、液体培养基、液体培养基 2、成分中有动物血清等、成分中有动物血清等适宜温度、适宜温度、PH和气体环境；无菌无毒环境和气体环境；无菌无毒环境2、体外培养细胞还需要什么样的条件？体外培养细胞还需要什么样的条件？3、动物细胞培养能否像绿色植物组织培养那样动物细胞培养能否像绿色植物组织培养那样最终培养成新个体？最终培养成新个体？不能，动物细胞培养只能使细胞数目增多，不能发不能，动物细胞培养只能使细胞数目增多，不能发育成新的动物个体育成新的动物个体 大规模的

7、生产有重要价值的生物制品大规模的生产有重要价值的生物制品 如病毒疫苗、干扰素、单克隆抗体如病毒疫苗、干扰素、单克隆抗体为基因工程技术提供受体细胞为基因工程技术提供受体细胞 培养健康细胞用于烧伤病人皮肤移植培养健康细胞用于烧伤病人皮肤移植有毒物质的检测有毒物质的检测细胞的生理、药理、病理研究细胞的生理、药理、病理研究 如用于筛选抗癌药物等，为治疗和预如用于筛选抗癌药物等，为治疗和预防癌症及其他疾病提供依据防癌症及其他疾病提供依据动物细胞培养技术的应用动物细胞培养技术的应用获得细胞获得细胞细胞的全能性细胞的全能性细胞株、细胞系细胞株、细胞系植物体植物体培养结果培养结果或细胞分泌蛋白或细胞分泌蛋白快

8、速繁殖、培育快速繁殖、培育无病毒植株等无病毒植株等培养目的培养目的葡萄糖、动物血清葡萄糖、动物血清蔗糖、植物激素蔗糖、植物激素培养基特有成分培养基特有成分液体培养基液体培养基固体培养基固体培养基培养基性质培养基性质细胞增殖细胞增殖原理原理动物细胞培养动物细胞培养植物组织培养植物组织培养比较项目比较项目植物细胞和动物细胞培养的比较植物细胞和动物细胞培养的比较二二.动物细胞动物细胞核移植技术和克隆动物核移植技术和克隆动物 将动物的一个细胞核，移入一个已经去掉细胞核将动物的一个细胞核，移入一个已经去掉细胞核的卵母细胞中，使其重组并发育成为一个新的胚胎，的卵母细胞中，使其重组并发育成为一个新的胚胎，这

9、个新的胚胎最终发育为动物个体（克隆动物）这个新的胚胎最终发育为动物个体（克隆动物）分分类类胚胎细胞核移植：胚胎细胞核移植：体细胞核移植：体细胞核移植：细胞分化程度低，恢复全能性容易细胞分化程度低，恢复全能性容易 细胞分化程度细胞分化程度高高，恢复全能性，恢复全能性不不容易容易 动物细胞动物细胞核移植概念：核移植概念：鱼类的核移植鱼类的核移植鲫鱼未受精的卵鲫鱼未受精的卵细胞核细胞核无核无核细胞细胞+细胞核细胞核鲤鱼囊胚细胞鲤鱼囊胚细胞无核无核细胞细胞组装细胞组装细胞鲤鲫移核鱼鲤鲫移核鱼鲤鲫移核鱼为例鲤鲫移核鱼为例:体细胞核移植的过程：体细胞核移植的过程：请看教材请看教材P48图图2-21思考：思

10、考：1.核移植的受体细胞是什么？处在什么时期？核移植的受体细胞是什么？处在什么时期？2.通过什么手段激活受体细胞，构建重组胚胎？通过什么手段激活受体细胞，构建重组胚胎？M中期卵母细胞中期卵母细胞诱导方法：物理或化学方法激活受体细胞，完成诱导方法：物理或化学方法激活受体细胞，完成细胞分裂和发育进程。细胞分裂和发育进程。去去 核核 过过 程程装核将准备好的体细胞放入去核卵母细胞的过程。将准备好的体细胞放入去核卵母细胞的过程。将将体细胞体细胞放入带下放入带下1.在体细胞的细胞核移植到受体卵母细胞之在体细胞的细胞核移植到受体卵母细胞之前，为什么必须先去掉受体卵母细胞的核？前，为什么必须先去掉受体卵母细

11、胞的核？为使核移植的胚胎或动物的遗传物质全部来为使核移植的胚胎或动物的遗传物质全部来自有重要利用价值的动物提供的体细胞，在供体自有重要利用价值的动物提供的体细胞，在供体细胞的细胞核移至受体细胞之前，必须将受体细细胞的细胞核移至受体细胞之前，必须将受体细胞的遗传物质去掉或将其破坏。胞的遗传物质去掉或将其破坏。培养的动物细胞一般当传代至培养的动物细胞一般当传代至1050代代左右时，部分细胞核型可能会发生变化，其左右时，部分细胞核型可能会发生变化，其细胞遗传物质可能会发生突变，而细胞遗传物质可能会发生突变，而10代以代以内的细胞一般能保持正常的二倍体核型。因内的细胞一般能保持正常的二倍体核型。因此，

12、在体细胞核移植中，为了保证供体细胞此，在体细胞核移植中，为了保证供体细胞正常的遗传基础，通常采用传代正常的遗传基础，通常采用传代10代以内代以内的细胞。的细胞。2.用于核移植的供体细胞一般都选用传代用于核移植的供体细胞一般都选用传代10代以内的细胞，想一想，这是为什么？代以内的细胞，想一想，这是为什么？3.你认为用上述体细胞核移植方法生产的克隆动物，是你认为用上述体细胞核移植方法生产的克隆动物，是对体细胞供体动物进行了对体细胞供体动物进行了100%的复制吗？为什么？的复制吗？为什么？绝绝大部分大部分DNA来自于供体细胞核，但其核外还有来自于供体细胞核，但其核外还有少量的少量的DNA，即线粒体中

13、的，即线粒体中的DNA是来自于受体卵母是来自于受体卵母细胞。细胞。此此外，即便动物的遗传基础完全相同，但动物的一外，即便动物的遗传基础完全相同，但动物的一些行为、习性的形成与所处环境有很大关系，核供体些行为、习性的形成与所处环境有很大关系，核供体动物生活的环境与克隆动物所生活的环境不会完全相动物生活的环境与克隆动物所生活的环境不会完全相同，其形成的行为、习性也不可能和核供体动物完全同，其形成的行为、习性也不可能和核供体动物完全相同，从这一角度看，克隆动物不会是核供体动物相同，从这一角度看，克隆动物不会是核供体动物100%的的复制。复制。多利羊之父多利羊之父 威尔穆特威尔穆特20042004年年

14、1 1月月2121日中国首例日中国首例异种克隆动物异种克隆动物 克隆北山羊在新疆乌鲁木齐降生克隆北山羊在新疆乌鲁木齐降生 将北山羊的体细胞与将北山羊的体细胞与山羊的卵母细胞结合组山羊的卵母细胞结合组成新的胚胎，成新的胚胎，待胚胎发待胚胎发育到一定阶段移植到发育到一定阶段移植到发情的母山羊体内。情的母山羊体内。北山北山羊是濒危动物，合作者羊是濒危动物，合作者都希望通过克隆技术来都希望通过克隆技术来保护它。保护它。体细胞核移植技术的应用前景：体细胞核移植技术的应用前景：1、在畜牧业中可以加、在畜牧业中可以加速家畜遗传改良的进程速家畜遗传改良的进程2、保护濒危物种、保护濒危物种3、医药卫生领域生产、

15、医药卫生领域生产医用蛋白质及组织器官医用蛋白质及组织器官的移植的移植4、了解胚胎发育和衰老过程；追、了解胚胎发育和衰老过程；追踪研究疾病的发展过程和治疗疾病踪研究疾病的发展过程和治疗疾病 1、成功率比较低2、大多存在健康问题3、克隆动物食品安全问题体细胞核移植技术存在的问题：体细胞核移植技术存在的问题：三、动物细胞融合三、动物细胞融合指用自然或人工方指用自然或人工方法、使两个或多个法、使两个或多个不同的细胞融合成不同的细胞融合成一个细胞的过程，一个细胞的过程，又称为体细胞杂交又称为体细胞杂交二、动物细胞融合二、动物细胞融合化学融合剂诱导化学融合剂诱导细胞融合融合过程原生质体电融合过程1）在高频

16、电流电场下的相互接触。2）脉冲刺激后30s3)50秒后4）1.5分钟后5）6分钟后6）15分钟后，原生质体融合完成。一般用高纯度的蒸馏水并选用适当的非电介质溶液，如甘露醇等配制等渗性介质细胞核细胞核病毒颗粒病毒颗粒细胞核细胞核灭活的灭活的病毒颗粒黏附在细胞表面病毒颗粒黏附在细胞表面细胞膜被病毒颗粒穿过细胞膜被病毒颗粒穿过细胞膜连接细胞膜连接二、动物细胞融合二、动物细胞融合细胞融合，形成杂种细胞细胞融合，形成杂种细胞思考：思考：融合的原理融合的原理融合的过程融合的过程诱导融合的方法诱导融合的方法融合的用途融合的用途比较植物体细胞杂交比较植物体细胞杂交与动物细胞融合的异与动物细胞融合的异同同动物细

17、胞融合动物细胞融合细胞融合方法化学：PEG（聚乙二醇）（聚乙二醇）物理：电融合：电融合生物：病毒（仙台病毒）：病毒（仙台病毒）仙台病毒仙台病毒紫外线紫外线丧失感染性丧失感染性（不感染细胞）（不感染细胞）保留融合活性保留融合活性（诱导细胞融合）（诱导细胞融合）主要用于制备主要用于制备单克隆抗体单克隆抗体获得杂种植株获得杂种植株用途用途物理、化学方法物理、化学方法（同左）（同左）灭活的病毒灭活的病毒物理（离心、振物理（离心、振荡、电刺激）荡、电刺激）化学（聚乙二醇）化学（聚乙二醇）诱导方法诱导方法使细胞分散后诱使细胞分散后诱导细胞融合导细胞融合去除细胞壁后诱去除细胞壁后诱导原生质体融合导原生质体融

18、合细胞融合的方法细胞融合的方法细胞膜的流动性细胞膜的流动性细胞膜的流动性、细胞膜的流动性、植物细胞全能性植物细胞全能性原理原理动物细胞融合动物细胞融合植物体细胞杂交植物体细胞杂交比较项目比较项目植物、动物细胞融合的比较植物、动物细胞融合的比较四、单克隆抗体四、单克隆抗体读读下面一段文字资料，思考以下问题：下面一段文字资料，思考以下问题：长期以来，为了获得抗体，采用的是把某种抗原反长期以来，为了获得抗体，采用的是把某种抗原反复注射到动物体内，然后从动物血清中分离出所需复注射到动物体内，然后从动物血清中分离出所需抗体的方法。用这种方法获得的抗体，不仅产量低，抗体的方法。用这种方法获得的抗体，不仅产

19、量低，而且抗体的特异性差，纯度低，反应不够灵敏。人而且抗体的特异性差，纯度低，反应不够灵敏。人们发现，在动物发生免疫反应的过程中，体内的们发现，在动物发生免疫反应的过程中，体内的B B细胞可以产生多达百万种以上的特异性抗体，但是细胞可以产生多达百万种以上的特异性抗体，但是每个每个B B细胞只分泌一种化学性质单一、特异性强的细胞只分泌一种化学性质单一、特异性强的抗体。要想获得大量的单一抗体，必须用单个抗体。要想获得大量的单一抗体，必须用单个B B细细胞进行无性繁殖，即克隆。胞进行无性繁殖，即克隆。什么是抗体？什么是抗体？由何种细胞产生？由何种细胞产生？主要分布在哪里？主要分布在哪里？起何作用？起

20、何作用？效应效应B细胞细胞血清血清特异性免疫作用特异性免疫作用抗体：机体受抗原刺激后产生的，抗体：机体受抗原刺激后产生的，并且能与该抗原发生特异性结合并且能与该抗原发生特异性结合的具有免疫功能的球蛋白。的具有免疫功能的球蛋白。克隆（clone）：亦称无性繁殖系或简称无性系。克隆（clone）：亦称无性繁殖系或简称无性系。克隆（clone）：亦称无性繁殖系或简称无性系。单克隆单克隆抗抗 体体讨论：怎样才能获得单克隆抗体？提示提示1：仅用细胞培养技术可行吗？：仅用细胞培养技术可行吗？提示提示2：我们所学的哪种细胞是可以无限：我们所学的哪种细胞是可以无限增殖的？增殖的？提示提示3：有什么方法能使：有

21、什么方法能使B细胞产生抗体的细胞产生抗体的能力和肿瘤细胞无限增殖能力同时具备呢能力和肿瘤细胞无限增殖能力同时具备呢？设计方案：设计方案：一个一个B B淋巴细胞只分泌一种特异性抗体淋巴细胞只分泌一种特异性抗体小鼠骨髓瘤细胞能无限增殖小鼠骨髓瘤细胞能无限增殖-化学性质单一、特异性强的抗体。化学性质单一、特异性强的抗体。杂种细胞杂种细胞单克隆单克隆抗抗 体体抗原抗原B淋巴细胞淋巴细胞骨髓瘤细胞骨髓瘤细胞杂交瘤细胞杂交瘤细胞细胞融合细胞融合、筛选、筛选细胞培养细胞培养筛选筛选提提 取取体体外外培培养养体体内内培培养养克隆（clone）：亦称无性繁殖系或简称无性系。单克隆抗体制备过程单克隆抗体制备过程为

22、什么要注射特定的为什么要注射特定的抗原抗原?第一次筛选的方法和第一次筛选的方法和目的是什么目的是什么?杂交瘤细胞具有什么杂交瘤细胞具有什么特点？特点？第二次筛选的方法和第二次筛选的方法和目的是什么目的是什么?获得单克隆抗体的场获得单克隆抗体的场所有那些所有那些?单克隆抗体的应用单克隆抗体的应用与与常规抗体相比，单克隆抗体产量高，特异性强，常规抗体相比，单克隆抗体产量高，特异性强，灵敏度高，优越性十分明显灵敏度高，优越性十分明显。应用主要有：应用主要有：1、临床诊断、临床诊断2、作为载体，运载抗癌药物，形成、作为载体，运载抗癌药物，形成“生物导弹生物导弹”治疗肿治疗肿瘤瘤资料资料：目前世界各国已

23、经研制出数以百计的单克隆抗目前世界各国已经研制出数以百计的单克隆抗体。许多缺乏良好诊断手段的传染病、免疫性疾病、体。许多缺乏良好诊断手段的传染病、免疫性疾病、血液病、内分泌疾病和遗传病，用单克隆抗体作为诊血液病、内分泌疾病和遗传病，用单克隆抗体作为诊断手段，是一个必然趋势。另外，用单克隆抗体做体断手段，是一个必然趋势。另外，用单克隆抗体做体内诊断，借以鉴别和定位体内内诊断，借以鉴别和定位体内“病灶病灶”也引起人们的也引起人们的注意，目前，主要用于肿瘤追踪及心肌梗塞的诊断。注意，目前，主要用于肿瘤追踪及心肌梗塞的诊断。小结小结两个过程两个过程动物细胞培养过程动物细胞培养过程单克隆抗体制备过程单克

24、隆抗体制备过程三三个个“一一”一个诱导细胞融合的新方法一个诱导细胞融合的新方法 灭活病毒灭活病毒一个新细胞杂交瘤细胞一个新细胞杂交瘤细胞一个优势单克隆抗体特异性一个优势单克隆抗体特异性 强、灵敏度高的优势强、灵敏度高的优势 下图为某同学根据杂交瘤技术的方法，设计的生产破伤下图为某同学根据杂交瘤技术的方法，设计的生产破伤风杆菌的实验方案风杆菌的实验方案2、该方案能达到预期效果吗？为什么？、该方案能达到预期效果吗？为什么？4、图中、图中B为为_过程，常用过程，常用_作为诱导剂，该细胞继作为诱导剂，该细胞继承承_的遗传特性，既能的遗传特性，既能_,又能又能_。1、该实验方案的目的是、该实验方案的目的

25、是_3、A是从小鼠的脾脏中取得是从小鼠的脾脏中取得_,该细胞能够产生该细胞能够产生_5、C过程指细胞培养，该过程包括过程指细胞培养，该过程包括_培养和培养和_培养两个阶段，其培养两个阶段，其中中_代以内的的细胞属于细胞株。代以内的的细胞属于细胞株。制备单克隆抗体制备单克隆抗体B细胞细胞抗体抗体细胞融合细胞融合灭活病毒灭活病毒双亲细胞双亲细胞分泌抗体分泌抗体无限增殖无限增殖原代原代传代传代50B体外培养体外培养骨髓瘤细胞骨髓瘤细胞杂交瘤细胞杂交瘤细胞足够数量的细胞群足够数量的细胞群注射到注射到小鼠腹腔小鼠腹腔AC练一练练一练A、B细胞为动物细胞细胞为动物细胞,请据图回答问题请据图回答问题:A细胞

26、细胞B细胞细胞C细细胞胞D细细胞胞(1)若若A细胞为骨髓瘤细胞细胞为骨髓瘤细胞B细胞为淋巴细胞细胞为淋巴细胞,那么那么D细胞细胞称为称为 细胞细胞,D细胞具有两个亲本细胞的特征细胞具有两个亲本细胞的特征,一一方面因具有骨髓瘤细胞的方面因具有骨髓瘤细胞的 性质性质,通过通过 方方式产生大量细胞式产生大量细胞,我们称之为我们称之为 过程过程;另一方面能另一方面能分泌大量的抗体分泌大量的抗体,我们把该过程分泌的抗体称我们把该过程分泌的抗体称 .杂交瘤杂交瘤连续分裂连续分裂有丝分裂有丝分裂单克隆单克隆单克隆抗体单克隆抗体练一练练一练(2)D细胞中产生的抗体其化学本质是细胞中产生的抗体其化学本质是 ,合

27、合成该物质的场所是成该物质的场所是 ,它是由它是由 控制控制合成的合成的,合成过程包括合成过程包括 和和 两个重要步骤两个重要步骤.球蛋白球蛋白核糖体核糖体基因基因转录转录翻译翻译(3)D细胞中产生的抗体具有细胞中产生的抗体具有 作用作用,与血清抗与血清抗体相比其优越之处在于体相比其优越之处在于 强强,高高.免疫免疫特异性特异性灵敏度灵敏度(4)若若A为人细胞为人细胞,B为鼠细胞为鼠细胞,用同位素标记用同位素标记A细胞膜上细胞膜上的蛋白质的蛋白质,B不标记不标记,在在C细胞时细胞时,检测结果发现整个细胞检测结果发现整个细胞一半有放射性另一半没有一半有放射性另一半没有.在在D细胞时细胞时,检测结

28、果发现整检测结果发现整个细胞都有放射性个细胞都有放射性,请解释原因请解释原因 .构成细胞膜的蛋白质构成细胞膜的蛋白质分子大都可以流动分子大都可以流动练一练练一练 单克隆抗体制备过程单克隆抗体制备过程病毒诱导融合病毒诱导融合;常用的病毒：仙台病毒常用的病毒：仙台病毒（Sendal virus),又称日又称日本血凝病毒本血凝病毒（Hemagglutinating virus of Japan,HVJ）属于副属于副粘液病毒科，粘液病毒科，RNA病病毒，圆球形毒，圆球形19621962年，日本仙台东年，日本仙台东北大学学者冈田发现北大学学者冈田发现仙台病毒可诱导细胞仙台病毒可诱导细胞融合。融合。单克隆抗体制备过程单克隆抗体制备过程注射抗原注射抗原B淋巴细胞淋巴细胞骨髓瘤细胞骨髓瘤细胞细胞融合、筛选细胞融合、筛选杂交瘤细胞杂交瘤细胞细胞培养细胞培养筛选，继续培养筛选，继续培养足够数量的、能产生足够数量的、能产生特定抗体的细胞群特定抗体的细胞群体外培养体外培养注射到小鼠腹腔注射到小鼠腹腔单克隆抗体单克隆抗体